干细胞分化/激素研究怎么选血清？活性炭处理胎牛血清选型与实操指南

1. 无菌条件下取新鲜脐带，用DPBS漂洗净血迹。
注：一般脐带取得非无菌环境，可以稍微用75%酒精润洗。

2. 置10 cm于培养皿中，剪成1~2cm脐段，剔除血管，用DPBS洗净血迹，再剪成1 mm3组织块。

图1. 剔除脐带3根动静脉血管

3. 用无菌滴管吸取少量细小组织块均匀散布在 6 孔板 2 个孔中。

4. 37℃，5% CO?培养箱孵育30min，以使组织块粘贴在培养皿壁上。

5. 向每孔滴加0.8 ml 完全培养基（注意沿孔壁小心滴加，勿使冲动组织块）。

6. 37℃，5% CO? 培养箱孵育过夜，次日（D1）每孔再补加1 ml 完全培养基。

7. 37℃，5% CO? 继续培养，5天（D6）后半量换液（此时一般看不到细胞，但最快3天就可看到细胞从组织边沿爬出）。

8. 再过5天后半量换液（此时一般会有细胞爬出，但最晚可到14天会出现细胞从组织边沿爬出）。

图2. 细胞从组织块边沿爬出

图3. 细胞快速增殖

图4. 传代时机成熟

9. 每2天换一次培养液，继续培养2~4天，待细胞融度（Confluency）达到约80%后传代培养。

注：组织块培养的关键是要保障组织块始终贴壁，换液动作要尽可能轻微，避免冲动组织块。培养基加量不能太多，以免组织块漂浮。

1、准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。

2、按照2×10?cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2ml，37℃、5% CO? 培养箱中培养。

3、当细胞融合达60%时，弃去培养上清，每孔添加MSC成骨诱导完全培养基2ml/孔，37℃、5%CO?培养箱中培养。
注意：成骨诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，切记避免吹起细胞。

4、每3天更换新鲜的MSC成骨诱导完全培养基，持续培养2-4周。
注意：细胞状态良好一般5天后培养液出现浑浊，不可与污染混淆，换液时尽量轻柔；7-10天左右出现钙沉积。一般2周内出现较大的较厚的钙沉积，透光性变差。有些细胞钙沉积出现较晚，一般不超过3周，超过3周未出现明显沉积，请注意分析操作步骤与其他原因。可根据具体实验需求选择终止时间，但不易超过4周。

5、诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。

6、弃去固定液，DPBS洗2次，加入茜素红染液1 ml/孔染色15分钟。

7、弃去茜素红染液，DPBS洗3次，添加新鲜DPBS。
注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。

8、显微镜下观察并拍照。
注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。

结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见红色着色点，此处为钙结节，说明实验所用的MSC具有成骨能力。否则，所使用的MSC无成骨能力。

1、准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。

2、按照3×10?cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2ml，37℃、5%CO?培养箱中培养。

3、当细胞融合达90%时，弃去培养上清，每孔添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO?培养。
注意：成脂诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，避免吹起细胞。细胞起始诱导融合度对诱导效果十分关键，必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。

4、诱导培养72 小时后弃去原培养上清，添加诱导液C 2 ml/孔，37℃、5%CO?继续培养。

5、继续诱导培养24 小时后弃去原培养基，添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO?继续培养。

6、重复步骤4、5约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液C继续培养。

7、一般在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡，5-9天融合为较大的亮泡，这些结构围绕在细胞核周围，较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程，若10天后仍未见脂滴结构，请注意分析操作步骤与其他原因。

8、每2天更换新鲜诱导液C，继续培养至脂滴足够大时培养结束。
注意：换液时诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。根据实验需要选择培养结束时间，若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现，建议提前终止。不同实验室MSC诱导时出现脂滴的时间不尽相同，若大面积出现脂滴较早，则可提前更换为诱导液C。

9、诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2ml/孔室温固定细胞20分钟。

10、弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液（工作液）1 ml/孔染色15分钟。
注意：该步骤适用于鉴定成脂能力，若出现脂滴（脂肪细胞）则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片，则染色时间需自己掌握。

11、弃去油红O染液（工作液），DPBS洗3次。
注意：油红O染色必须配制成染色工作液，否则无法着色；染色工作液现配现用。染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。

12、显微镜下观察并拍照。
注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。

结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则，所使用的MSC无成脂能力。
注意：该判定标准仅进行定性分析，若需要进行定量分析，需要自行制定方案。

1、准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。

2、220 g离心5 分钟，沉淀以预混液重悬，细胞密度约2×10? cells/ml，再次离心，弃上清。

3、沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为2×10? cells/ml。

4、分别取500 μl 细胞悬液接种于15 ml离心管中，220 g离心5 分钟。
注意：每管细胞的总数在5×10?至1×10?之间，一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为佳，细胞数过少形成的软骨团块较小，细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可形成1-2 mm3的团块。离心以细胞聚团为准，可适当调整。离心力过大，软骨球不易悬浮，离心力过小则可能形成软骨球效果不佳。

5、旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37 ℃、5% CO?培养箱中静置培养。
注意：24 小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。

6、诱导培养24 小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。
注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48小时之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固，可用移液器轻轻吹动使其悬浮，注意不要吹散团块。

7、每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸去旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500μl。
注意：换液时动作轻柔，以免吸出细胞团块；诱导完全培养基必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-3 周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。

8、诱导培养14-20天，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
注意：一般软骨球诱导致密后能进行染色处理，时间在14-20天左右，时间过久可能导致团块内部出现空泡，甚至团块裂开，具体时间请以自己细胞的特性自行确定。

9、弃去固定液，DPBS洗团块2次。

10、阿利新蓝染色：向团块中加500 μl阿利新蓝染液染色30分钟。弃染色液，加纯水5 ml摇动清洗5分钟/次，反复洗5次。
注意：染色液中的团块不易看清，务必小心吸去上清，避免样本丢失。

结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见深蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

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