K562细胞怎么养？保姆级SOP教学及注意事项

K562为人慢性髓原白血病细胞，是慢性髓系白血病、造血分化和新药筛选等研究常用悬浮模式细胞。细胞悬浮生长，圆形、透亮、单个或少量疏松聚集生长，对细胞密度、吹打力度、血清品质十分敏感，操作稍有不当极易诱导分化、甚至凋亡。本文将针对K562的细胞培养流程进行梳理和指导。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至37℃；9mL完全培养基37℃预热；生物安全柜紫外照射灭菌30min；

2.【融化】液氮取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1?2min

3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，移入生物安全柜开盖，细胞悬液缓慢滴入装有9mL预热完全培养基的15mL离心管；

4.【离心】600rpm离心5min，小心吸弃上清；

5.【重悬】加入 1mL完全培养基轻柔吹打约10次；取全新10cm培养皿，皿盖标注细胞名称、传代人、代数、日期，加入9mL完全培养基，再加入1mL细胞悬液，十字轻晃混匀；

6.【培养】放入37℃、5% CO?培养箱静置培养。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制完全培养基：1640 基础培养基（abs9484?500mL）+10% FBS（abs972?500mL）+1% 双抗 (P/S)（abs9244?100ml）；提前取出PBS（abs962?500ml）、完全培养基，恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。

注意：该细胞传代过程中所有试剂均需要恢复至室温。

2.【镜检】显微镜观察，细胞密度达到80%、培养基轻微变黄、轻晃培养皿可见大量透亮悬浮细胞，即可传代；

3.【细胞收集】将所有细胞悬液收集至15mL离心管中；

4.【离心重悬】600rpm离心5min，吸弃上清；加入3ml完全培养基，轻轻吹打10次左右重悬；

注意：如果细胞状态较差或者细胞碎片较多，在这一步弃去上清后，加入10mL PBS吹打重悬，600rpm离心去上清后再进行传代。

注意：该细胞对机械吹打高度敏感，严禁大力、反复吹打。

5.【传代】准备一个新的10cm培养皿，在皿盖上标注细胞名称、传代人、代数、日期。加入9mL完全培养基，再加入1mL细胞悬液，十字轻晃混匀；

注意：该细胞传代比例建议为1:3?1:4，可根据传代比例加入适量完全培养基；

6.【镜检】显微镜下确认细胞分散均匀后，放入37℃、5%CO?培养箱观察培养。

三、细胞冻存

1.【准备工作】细胞冻存液可使用无血清细胞冻存液（abs9417?100mL），也可以自行配制：90%FBS（abs972?500mL）+10%DMSO（abs9187?100mL）。存管提前标注：细胞名称、代数、冻存人、冻存日期。生物安全柜提前使用紫外照射30min；

注意：该细胞对冻存密度敏感，建议单个皿冻存2?3只。

2.【细胞收集】细胞密度长到80%左右，按照传代步骤进行细胞收集，600rpm离心之后弃上清；

3.【细胞重悬】加入3mL细胞冻存液，轻轻吹打重悬细胞；

4.【冻存】每管加入1mL混合液至冻存管中，将冻存管放入冻存盒中，放入?80℃冰箱，过夜后转移至液氮罐中。

四、关键注意事项

1. 严格管控培养密度：
细胞浓度维持在2×10⁵?1×10⁶cells/ml，培养基发黄需立即传代；

2. 血清选择：
K562正常情况下极少数贴壁。若出现明显贴壁，建议更换血清或重新复苏原始冻存株，该细胞推荐使用优级血清；

3. 支原体污染防控
悬浮细胞是支原体污染高发群体，全程严格无菌操作，每月开展一次支原体检测；

4. 控制培养密度，轻柔操作
K562大多死于细胞密度过高或离心转速过高，必要时用40 μm细胞筛网过滤后重新培养。

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