稳定mRNA降低免疫原性的神器—修饰核苷酸

2022-05-06

信使 RNA (mRNA) 等外源性分子介导的生物疗法，其应用面临的一个主要障碍就是其免疫原性，因为体外合成的 mRNA 具有较高的免疫原性，可能会诱发大量炎症反应，不仅无法取得预期的治疗效果，还会引起强大的副作用。关于如何降低体外合成mRNA分子的免疫原性，在过去的十几年中，科学家们进行了大量相关研究，其中，较为重要的发现之一就是多种修饰核苷酸，而含有各种修饰核苷酸的 mRNA，如假尿苷和N-6-甲基腺苷，可以有效降低mRNA的免疫原性，抑制先天免疫激活，使 mRNA可能成为再生医学、疾病治疗和细胞重编程的有力工具。

迄今为止，已经发现并验证的多种核苷酸化学修饰策略可以降低免疫原性而不影响其翻译特性，例如将天然腺苷替换为N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）；替换天然胞嘧啶核苷为5-甲基胞嘧啶核苷（m5C）；以及将天然尿苷替换为5-甲氧基尿苷（5moU），假尿苷（ψ）或N1-甲基假尿苷（m1ψ）等。其中，m5C和ψ备受关注，因为无论是体内还是体外都表明，它们在有效降低mRNA免疫原性的同时，也显著提高了其翻译效率。

图1：mRNA的化学修饰汇总[1]

一、核苷酸修饰简介

1、Pseudo-UTP (Ψ)

假尿苷（Pseudouridine）是RNA上最丰富的修饰核苷，又被称为RNA的“第五种核苷”。mRNA 假尿嘧啶化修饰的过程是由假尿嘧啶合成酶进行催化，让尿嘧啶核苷酸（U）化学结构发生改变，形成假尿嘧啶核苷酸。已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。2005年，Katalin Karikó等人发现将假尿苷引入RNA中能降低其免疫原性，并且RNA的免疫原性随着假尿苷引入比例的增高而降低[2]。2008年，Katalin Karikó等人还发现用假尿苷完全替代尿苷的mRNA不仅能极大地降低mRNA的免疫原性，还能提高mRNA的稳定性并增强其翻译能力[3]。

2、N1-Methylpseudo-UTP (mΨ)

N1-methyl-pseudouridine 是一种甲基假尿苷，通过增加核糖体密度，mRNA 中的 N1-methyl-pseudouridine 以 eIF2α 依赖性和独立机制增强翻译。2015年，Oliwia Andries等人发现用N1-甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力[4]。

3、N6-Methyl-ATP（m6A）

早在 20 世纪 70 年代，科学家们就在 RNA 中发现了 m6A 修饰，但其功能则由于技术制约一直未能被很好的揭示。直到 2012 年，科学家们的研究表明，m6A 修饰和mRNA 的稳定性、剪接加工、翻译以及 microRNA 的加工有关[5,6]。 2018年，Shinichiro Akichikade等人还发现在5'-加帽的mRNA帽子上含有92% 的m6Am和8%的Am，可促进mRNA的翻译[7]。

4、5-Methyl-CTP (5mC)

在 mRNA 中，m5C 修饰连同多种效应酶，例如 NOP2/Sun RNA 甲基转移酶 2 (NSUN2)、NSUN6,38 tRNA 天冬氨酸甲基转移酶 1 (TRDMT1) 和 Aly/REF 输出因子 (ALYREF)，执行多种功能，包括促进 mRNA 核胞质运输；病毒蛋白表达； DNA损伤修复；mRNA 稳定性；细胞耐受性、增殖和迁移；干细胞的发育、分化和重编程； mRNA 剪接的调控[8]。此外，m5C的分布因细胞类型而异。在mRNA的特定位置上的m5C修饰表现出不同的调控活性:它们可以促进或抑制翻译[9]。

5、5-Methoxy-UTP(5moU)

5-甲氧基尿苷(5moU) 是一种罕见的核苷，存在于tRNA中。它由β- D-核糖尿嘧啶（糖）和核碱基 5-甲氧基尿嘧啶组成，是尿苷的衍生物。RNA (mRNA) 中加入 5-甲氧基尿苷可以降低所得mRNA 的免疫原性。2022年，Hanieh Moradian等人发现尿苷的化学修饰，特别是5moU，显示出最高水平的蛋白质产生，而对炎性巨噬细胞反应的诱导可忽略不计[10]。

二、核苷酸修饰应用案例

图2：mRNA的化学修饰能够显着改善表达，但因细胞类型和编码序列而异[1]

核苷酸修饰类型	功能/应用
Ψ、mΨ[11]	用N1-甲基假尿苷完全替代尿苷比用假尿苷完全替代尿苷更能降低mRNA的免疫原性，且更能增强mRNA的蛋白表达能力
mΨ[12,13]	Moderna COVID-19疫苗（mRNA-1273）和BioNTech COVID-19疫苗（BNT162b）
m6A、Ψ、mΨ、2FdU、5mC、5hmC、5moC和2 2FdC[14]	与未修饰的 mRNA 相比，具有修饰核苷酸的每种 mRNA 减少了 IFN-β 的产生, 逃避或抑制先天性免疫信号
ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU[15]	五种修饰的FLuc mRNA（ψ、mψ、5mC/ψ、5hmC/5mU 和 5moC/5mU-FLuc mRNA）显著优于未修饰的 FLuc mRNA 的活性。
Mψ、5moU、ψ[16]	mRNA的化学修饰能够显着改善蛋白质表达，这取决于细胞类型和编码序列。具有mψ、5moU和ψ修饰的eGFP mRNAs在测试的细胞系中表达排名前三。5moU 修饰的 eGFP mRNA 比其他 eGFP mRNA更稳定。

爱必信提供以下几种修饰核苷酸

修饰碱基	类型	特点
	假尿苷（Pseudo-UTP；Ψ）、	提高mRNA的稳定性、提升翻译效率、降低免疫原性
	N1-甲基-假尿苷（N1-Methylpseudo-UTP）
	5-甲基-胞苷三磷酸（5-Methyl-CTP）
	5-甲氧基-尿苷三磷酸(5-Methoxy-UTP)
	N6-甲基-腺苷三磷酸(m6A,N6-Methyl-ATP)

修饰核苷酸产品列表

货号	名称	规格
abs60188	5-甲氧基-CTP锂盐溶液	10μL/50μL/1mL
abs60169	5-甲氧基-UTP钠盐溶液	10μL/50μL/1mL
abs60189	5-甲氧基-UTP锂盐溶液	10μL/50μL/1mL
abs60168	5-甲基-CTP钠盐溶液	10μL/50μL/1mL
abs60159	ATP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60163	CTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60164	GTP Sodium salt solution（100 mM）	1ml×3
abs60165	UTP Sodium salt solution（100mM）	1ml×3
abs60186	N1-甲基-假尿苷三磷酸四锂盐溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60156	N1-甲基-假尿苷三磷酸四钠盐溶液/N1-Methyl-Pseudo-UTP	10ul/50ul/1mL
abs60187	N6-甲基-ATP锂盐溶液	10ul/50ul
abs60158	NTP 钠盐混合溶液（含ATP、CTP、GTP、UTP）	1ml×3
abs60185	假尿苷三磷酸四锂盐溶液/Pseudo-UTP, lithium salt solution	10ul/50ul/1ml
abs60155	假尿苷三磷酸四钠盐溶液/Pseudo-UTP, Sodium salt solution	10ul/50ul/1ml

[1] Xiao, Dong, Yizhou. Effects of Chemically Modified Messenger RNA on Protein Expression. Bioconjug Chem. 2016 Mar 16;27(3):849-53.

[2] Karikó, K., Buckstein, M., Ni, H., & Weissman, D. (2005). Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity, 23(2), 165–175.

[3] Karikó, K., Muramatsu, H., Welsh, F. A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., & Weissman, D. (2008). Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, 16(11), 1833–1840.

[4] Andries, O., Mc Cafferty, S., De Smedt, S. C., Weiss, R., Sanders, N. N., & Kitada, T. (2015). N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society, 217, 337–344.

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[15] Durbin AF, Wang C, Marcotrigiano J, Gehrke L. RNAs Containing Modified Nucleotides Fail To Trigger RIG-I Conformational Changes for Innate Immune Signaling. mBio. 2016 Sep 20;7(5):e00833-16. doi: 10.1128/mBio.00833-16.

[16] US20200172935A1