What is Co-IP?
Co-IP全称Co-Immunoprecipitation,中文学名免疫共沉淀,是一种以抗体和抗原识别专一性为基础,用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。
通俗点来说,假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用,首先我们通过合适的方法处理样本,将蛋白提取出来(同时不能破坏蛋白之间的相互作用),然后用预先结合了琼脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗体捕获样本中的A蛋白,那么与A蛋白结合的B蛋白也能一起沉淀下来。再将蛋白从珠子上裂解下来,对B蛋白进行检测,能检测到,说明B蛋白在之前的沉淀过程中随着A蛋白一起被拉下来了,进而证明二者之间存在相互关系。
How to do?
A few tips:
※ 如何理解文献中的结果?
各名称解析:
IB:全称immunoblotting,即免疫印迹,也就是常规的Western Blotting,用于显示目的蛋白。
IP:全称immunoprecipitation,即免疫沉淀,这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。
Input:全细胞裂解液,含有细胞内所有的蛋白,可认为是阳性组。也就是处理完样本得到的细胞裂解液,在做IP实验之前,需要先跑WB,确认样本中含有蛋白A和蛋白B。
Anti-A:A蛋白的免疫共沉淀抗体
IgG:Anti-A的同型对照抗体,即跟Anti-A同来源同种型,如Anti-A是兔来源IgG型,则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG(abs20035)
结果图解析:
该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。本实验一共分为两大组:Input组及IP组,其中IP组又分为IgG组(阴性对照组)和实验组,并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。由Input组的条带可以得到结论:蛋白A与蛋白B都是存在的,证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验,结果蛋白A与蛋白B均没有条带,说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来,证明蛋白A和B与IgG没有结合,排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性;而实验组蛋白A和B均有条带,表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验,成功把蛋白A沉淀下来了,与此同时蛋白B也被沉淀下来,进而得到结论:蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。
确切来说,试剂盒的50T代表着能够完成50次免疫沉淀反应,而实际上免疫共沉淀实验需要设置多个组别进行对照验证,因此具体能够完成多少次Co-IP实验由设计方案决定,一般至少需要设置阴性对照、阳性对照、实验组三个组别。
这个步骤的目的是为去除样本中可与protein A/G琼脂糖珠非特异结合的蛋白质,减少干扰,非必做,如CoIP实验中发现有较多杂带,可考虑做一下;但应注意,选择此步骤后,需要消耗琼脂糖珠,后续能够进行免疫沉淀的次数也相应减少。
※ 出现假阳性结果该怎么排除?
可能出现假阳性结果的成因 |
对照组设置 |
琼脂糖珠与X蛋白发生非特异结合 |
琼脂糖珠+抗体X+抗体Y |
琼脂糖珠与Y蛋白发生非特异结合 |
琼脂糖珠+蛋白Y |
抗体X和目的蛋白Y非特异性结合 |
琼脂糖珠+抗体X+蛋白Y |
抗体的非特异性结合 |
IgG+蛋白X+蛋白Y |
对于内源性Co-IP实验,阴性结果不能百分百说明无相互作用,也有可能是蛋白在细胞内表达过低导致,因此建议先做过表达Co-IP作为对照。
IP&WB全套试剂清单推荐
货号 |
品名 |
规格 |
货期 |
abs955 |
免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒 |
50tests |
现货 |
abs9146 |
PMSF(苯基甲基磺酰氟) |
5g/25g/100g |
现货 |
abs9116 |
Lysis Buffer for WB/IP Assays |
100ml |
现货 |
abs9239 |
Lysis Buffer for WB/IP Assays (Without Enzyme Inhibitors) |
100ml |
现货 |
abs20035 |
Rabbit IgG |
10mg |
现货 |
abs20038 |
Mouse IgG |
1mg |
现货 |
abs9232 |
BCA蛋白定量试剂盒 |
500次 |
现货 |
abs9389 |
BIS-Tris Gels 预制胶10%, 10 wells |
10片/盒 |
现货 |
abs924 |
预染蛋白marker, 10-180kDa |
2*250ul |
现货 |
abs950 |
10*电转液 |
1L |
现货 |
abs954 |
WB专用一抗二抗稀释液 |
100ml |
现货 |
abs961 |
10×PBS缓冲液 |
500ml |
现货 |
abs952 |
10*TBST |
1L |
现货 |
abs9157 |
牛血清白蛋白(BSA) |
100g |
现货 |
abs920 |
ECL化学发光检测试剂盒 |
2*25ml |
现货 |
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Absin特色产品线:
WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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