细胞染色专题——荧光染料选择指南

2023-03-07

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光学显微镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法。细胞染色是研究细胞生物学特征的一种常用手段，然而，对于细胞实验新手来说，想要获得一张漂亮的细胞染色图并不容易。染色试剂不会选、细胞染色不均匀、染色时切片脱落等都是很常见的问题。今天小爱就为大家整理了几种常用细胞染色方法及染色剂选择指南，快来学习！

表1 几种常用细胞染色方法及特点

染色方法	染色特点及应用范围
革兰氏染色法	一种重要的细菌鉴别染色法，经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。
瑞氏染色法	瑞氏试剂中酸性伊红和碱性美蓝混合经化学作用后，变成中性的伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞中的NH³⁺和COO^-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆以及其中颗粒显色较为清楚。
姬姆萨染色法	病理学以及疾病研究中常用的染色剂。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。
免疫组化染色法	利用抗原抗体之间的特异性结合，用于研究细胞产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移等。

了解细胞染色方法后，下面小爱向大家介绍研究不同细胞结构用到的荧光染料。

一、细胞膜常用染料

DiD、DiR、DiO和DiI染料是最常见的细胞膜染料（见表2），它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后，会在整个细胞膜上侧向扩散，在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中DiD染料的染色效率高，染色均一，荧光不易猝灭，无明显细胞毒性，且受自身荧光背景干扰小。目前DiD已成功应用于多种细胞的体内示踪研究，如Treg细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等。

表2 细胞膜常用染料及荧光颜色

货号	产品名称	荧光颜色	λEx(nm)/ λEm (nm)
abs47048165	DiD 对氯苯磺酸盐	红色	644/663
abs45153692	DiR 碘化物	深红色	748/780
abs45153674	DiO 高氯酸盐	绿色	484/501
abs42002237	DiI 高氯酸盐	橙色	549/565

二、其他细胞结构常用染料

生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用，除细胞膜研究外，我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索，例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等，而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色，小爱总结如下：

表3常用细胞染料及用途

货号	产品名称	产品用途
abs47047616	DAPI染色液	细胞和组织细胞核染色。
abs47048270	TRITC-Phalloidin	选择性结合丝状肌动蛋白F-actin，用于细胞骨架研究。
abs47047622	台盼蓝染色液（0.4%）	常用于检测细胞膜完整性和细胞存活率。
abs47047618	姬姆萨染液	用于染色体、血液、组织切片、原生动物寄生虫等。
abs47047620	Hoechst 33342	标记DNA，也用于细胞核和线粒体的显像观察。
abs47047744	JC-10	可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
abs47014951	吖啶橙盐酸盐	细胞周期研究，细胞培养物和组织模型的凋亡研究。也能用作溶酶体染料，但缺乏特异性。
abs42023979	(+)生物素-N-琥珀酰亚胺基酯	在温和条件下标记蛋白质、肽、细胞器、抗体、寡核苷酸和微珠。

三、细胞染色神器DAPI + Phalloidin

DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于细胞核染色，可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽（Phalloidin）是细胞骨架的染色神器，罗丹明标记的Phalloidin（TRITC- Phalloidin）可将细胞染成橙红色，DAPI与Phalloidin染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂，染色效果可见图1^[1]：A1-E1用TRITC-鬼笔环肽（橙红）染色的细胞骨架免疫荧光图；A2-E2用DAPI（蓝色）染色的细胞核免疫荧光图；A3-E3合并的L929细胞免疫荧光染色图。图2^[2]是S100A16过表达或下调前后PDAC细胞形态的变化。

注意事项：
※ 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测；
※ 避免反复冻融，否则容易失效；
※ DAPI对人体有刺激性，注意适当防护；
※ 鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量 LD₅₀约 2mg/kg）。

参考文献：

[1] Li J, Chen JN, Peng ZX, et al. Multifunctional Electrospinning Polyhydroxyalkanoate Fibrous Scaffolds with Antibacterial and Angiogenesis Effects for Accelerating Wound Healing[J]. Applied Materials & Interfaces. 2022.

[2] Li T, Ren TY, Huang CM, et al. YS100A16 induces epithelial-mesenchymal transition in human PDAC cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[J]. Biochemical Pharmacology 189 (2021) 114396.

常见问题解答（FAQ）

Question	Answer
Q1：用DAPI和鬼笔环肽染细胞的先后顺序是什么？	一般情况下先用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色20~40分钟，PBS清洗细胞2次，再用DAPI复染10~20分钟。可根据实际染色情况缩短或延长时间。
Q2：用DAPI染细胞核时，整张图片显示蓝色是什么原因？	染色时应注意滴加量不要太多，否则会造成整张图像呈现蓝色背景，只需覆盖上薄薄的一层即可。此外，荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
Q3：DAPI染色中避光的操作到底要多严格才不至于影响结果？	DAPI相对很容易染上色，避光处理时加样等操作短时见光没有关系，但是不操作的时候需要暗盒或锡纸包裹，染色后应尽快检测。
Q4：我的细胞样品转染了带有GFP的质粒，应该选择哪种鬼笔环肽？	可以选择TRITC（橙红）或是Fluor 700（远红）标记的鬼笔环肽。
Q5：鬼笔环肽有好多种，它们的区别是什么？我应该如何选择？	主要是荧光基团的差异，激发不同的荧光颜色，用来区分共染时其他荧光染料的颜色，选择时应满足机器激发和发射波长。
Q6：鬼笔环肽可以染活细胞吗？什么染色剂可以染活细胞？	鬼笔环肽不能直接应用于活细胞的染色，因为它无法穿越细胞膜。DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

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