多重荧光免疫组化Q&A（第一弹）

Q1：我想要进行多色实验，对于我的样本有什么要求吗？
A1：您按照免疫组化的标准对您的样本进行前处理即可。如果是从历史切片或者蜡块中挑选用来做多色，请尽量选取相对较新的样本（一个月内），最长不要选保存超过半年的样本，可能会有靶点缺失或者强非特异性，导致染色效果欠佳。

附上石蜡切片样本处理推荐：

1）取新鲜组织（理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm），如取的组织过大，需要切小后再做固定，以免组织太厚固定液渗透不良，导致后续染色效果不佳；

2）组织离体后（不要超过30分钟）迅速转移到固定液中（一般选用10%中性福尔马林或4%多聚甲醛），在常温条件下固定时间为18-24小时，不要固定太长时间，容易导致组织抗原丢失，影响阳性信号显色；

3）浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，容易导致后续染色过程中组织脱片；

4）切片厚度最佳为4微米，组织太厚容易导致染料渗透不加，且多层细胞之间荧光发生串扰，影响成像观察。贴片需选用免疫组化专用的防脱载玻片，不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，捞片后竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片；

5）切片在45℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右，到干片为止，否则后续染色过程中易脱片。但需要注意温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，因为在高温干燥条件下会加速组织切片中抗原的氧化。
 

Q2：如果我的样本是冰冻切片或者细胞爬片，可以用来做多色实验吗？
A2：可以的，多色实验本身不局限您的样本类型，但需要注意的是您的切片或者爬片能否经得起多轮抗体洗脱，在样本不脱片的情况下，才能有一个比较好的染色效果。如果您是这类样本，您需要额外准备一瓶抗体洗脱液（），替代多色实验中的热修复步骤，采用温和的洗脱方式，避免高温高压破坏切片。需要注意的是，您依旧需要控制切片厚度，尽量保证在单层细胞的厚度，如太厚，多层细胞之间发生重叠，荧光信号会发生串扰。（PS：石蜡切片是最适合做多色实验的样本类型！）


Q3：我该如何选择用于做多色的抗体呢？
A3：多色这项技术最突出的一个优势就在于对一抗种属没有特殊的限定，根据样本种属选择即可，我们试剂盒本身配备了二抗（鼠兔通用二抗或者抗兔二抗），您在选取一抗来源的时候，尽可能选择兔子或者小鼠来源的一抗，如确实找不到鼠或兔来源的一抗也没有关系，您只需要再准备一个跟该一抗来源适配的能用于免疫组化的HRP二抗即可。另外，您的一抗需要能应用于IHC，并且尽量选择单克隆抗体，多抗往往容易产生非特异性。


Q4：我注意到你们多色试剂盒中也是荧光染料，我在操作过程中需要额外避光吗？
A4：不用的，您在常规日光灯环境下操作就可以，我们染料的荧光强度很高，不会那么容易淬灭，但涉及到需要孵育或者保存的时候还是建议您采用避光湿盒进行。


Q5：我今天做好了多色片子，但无法立即进行扫描观察，我该怎么保存呢？
A5：染好的多色片子可以避光在4℃条件下保存较长的时间，但我们建议您完成染色以后，在两周内完成成像，并且如果需要长时间保存，建议您用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。如保存时间过长，或保存不当，封片剂容易干掉，此时再成像会有较强非特异性，可以使用PBS把盖玻片洗下来，重新封片以后再观察，但成像效果依旧会打折扣，还是建议您尽快完成成像。（PS：虽然荧光染料没有那么容易淬灭，但若多次成像反复激发，依旧会淬灭，2-3次影响不会很大，但不排除偶然性哦）


Q6：整个多色实验一般需要多久能够完成呀？一天能行吗？
A6：如果您的指标比较少（2~3个指标），恰好您又是“肝帝”愿意熬夜做实验，那么一天是可以做完的哦，因为我们多色染料有信号放大的功能，且试剂盒搭配的二抗是多聚的HRP二抗，也能放大信号，因此原本需要4℃过夜的一抗孵育，可以在室温1小时，或者37℃烘箱一小时完成，满打满算一天是可以做完实验的。但如果您不想要这么“肝”，当然可以，您只需要在一抗孵育的步骤选择4℃过夜，第二天再来继续做二抗孵育等后续操作就行，跟您做IHC实验一样，当您指标比较多的时候，可以合理安排，部分抗体室温1小时，部分抗体4℃过夜，但也不可把“战线”拉得太长，控制在尽可能短的时间完成实验，毕竟迟则生变哦。

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