小动物活体成像中荧光染料的选择及应用

小动物活体成像技术（in vivo imaging technology）是利用高灵敏度的光学检测仪器直接检测动物活体体内的细胞活动和基因行为研究的一类技术，是近年来发展最快的生命科学研究方法，是最直接观察细胞和分子在体内行为的新兴技术，已广泛应用于生命科学研究的各个领域[1]。

活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光发光两种技术。生物发光是利用荧光素酶报告基因在活体内表达产生的荧光蛋白与体外注射的荧光素底物发生化学反映产生荧光。而荧光发光成像技术是将荧光物质或荧光物质标记的小分子物质如基因、细胞也可是小分子药物、抗体、纳米材料等导入到活体体内，通过小动物活体成像系统的激发光源激发荧光集团到达高能量状态，而后产生波长较激发光长的发射光，然后通过高灵敏度制冷CCD镜头探测到活体内的发射光。通过活体成像技术可以观测活体动物体内肿瘤的生长和转移、炎症的发生、特定基因的表达和药物作用效果等生物学过程。

本期小爱主要为大家介绍小动物活体成像实验中常用的荧光染料及文献研究思路！

一、D-荧光素   

D-荧光素是萤光素酶的底物，在镁离子存在下荧光素酶使荧光素与ATP反应，发出黄绿色的光。可与小动物活体成像系统配套使用，用于体内活体荧光检测。

应用案例：子宫内膜癌腹膜转移异种移植模型的研究[2]

首先构建含IL-37BΔ1-45或NC的CV146/荧光素酶慢病毒载体，感染筛选稳定表达的细胞（ISK-LV-IL37b、Δ1-45和ISK-LV-NC）。然后将稳定表达的细胞腹腔注射到小鼠体内建立子宫内膜癌腹膜转移模型。

饲养38天后，对所有小鼠腹腔注射底物D-荧光素（）。10分钟后，小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠溶液。5分钟后，使用体内成像系统光谱对小鼠进行体内生物发光成像（图1）。然后处死小鼠，取出器官（肝、肺和肾）进行成像。取部分肿瘤及上述脏器用福尔马林固定，石蜡包埋，其余冰冻于?80°C进行HE染色、免疫组化染色、免疫印迹。

图1  IL-37b抑制子宫内膜癌腹膜转移异种移植瘤模型的研究[2]（abs42017256 D-荧光素）

二、DiR 碘化物   

DiR 碘化物是一种亲脂性的荧光染料，经常用来染细胞膜和其它脂溶性生物结构。由于DiR的近红外荧光可以穿透细胞和组织，因此在小动物活体成像技术中也经常使用。

应用案例：用DiR标记纳米胶束，评价胶束的肿瘤靶向性以阻止缺氧肿瘤的耐药和转移[3]

采用薄膜分散法制备壳寡糖（COS）包被、唾液酸（SA）受体靶向的顺铂（CDDP）和一氧化氮（NO）共载体纳米胶束（CTP/CDDP），并用DiR标记胶束，然后利用体内成像系统评价CTP/CDDP/DiR的肿瘤靶向性。如图2a所示，游离DiR在注射后经历了快速的药物代谢和血液循环清除，在肿瘤内几乎检测不到其荧光信号。DiR标记的CTP/CDDP胶束给药后3h，肿瘤组织内可见明显的荧光，且荧光强度随时间延长而增强。

具有智能靶向性的CTP/CDDP胶束增加了细胞对CDDP的摄取，增强了对肿瘤的细胞毒性，但降低了对正常器官或组织的全身毒性。在抗肿瘤机制方面，CTP/CDDP通过下调缺氧诱导因子-1α、谷胱甘肽2、多药耐药相关蛋白和基质金属蛋白酶9的表达，减少顺铂外流，抑制肿瘤上皮间充质转化过程，从而逆转缺氧肿瘤细胞的耐药和转移。

图2 DiR标记抗肿瘤纳米胶束在小鼠体内示踪肿瘤组织[3]（abs45153692 DiR 碘化物）

此外，用于生物标记的Cyanine 7.5（一种发近红外荧光的花青素荧光染料）由于其荧光波长很长，发射峰（Em max）大于 800nm，恰好处于肌体组织近红外窗口I的区域（肌体的血液，体液和组织此区域背景荧光弱，而长波长穿透性强），所以Cy7.5的标记物也常应用于小动物活体体内成像。

参考文献：

[1] Ntziachristos V. Going deeper than microscopy：the optical imaging frontier in biology[J]. Nature Methods，2010,7(8):603-614.

[2] Wang X, Wei Z, Tang Z, et al. IL-37bΔ1-45 suppresses the migration and invasion of endometrial cancer cells by targeting the Rac1/NF-κB/MMP2 signal pathway[J]. Laboratory Investigation [2023-06-12]. DOI:10.1038/s41374-021-00544-2.

[3] Chen Y, Fang L, Zhou W, et al. Nitric oxide-releasing micelles with intelligent targeting for enhanced anti-tumor effect of cisplatin in hypoxia.[J].Journal of Nanobiotechnology, 2021(1).DOI:10.1186/S12951-021-00989-Z.

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