【Western Blot】干货！WB步骤及好物分享

蛋白质免疫印迹（Western blot ,WB），是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。

经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

Western blot操作繁琐且环节众多，实验人员无意中犯错的概率随之增加，极大影响了其准确性和重复性，就操作难度而言，WB在一众实验中名列前茅，以下是WB步骤及好物分享。

一、试剂准备

1）10x 电泳液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g和SDS 10g，量取800ml ddH₂0，充分搅拌溶解后，定容至1L；
2）10x 电转液：Tris Base 30.3g、Glycine 144g，量取800ml ddH20，充分搅拌溶解后，定容至1L；
3）1x 电泳液：10x 电泳液100ml，加水定容至1L；
4）1x 电转液：10x 电转液100ml，甲醇200ml，最后加水定容至1L；
5）10x TBS：Tris-base 60.6g、NaCl 87.66g，量取800ml ddH₂0，充分搅拌溶解后，定容至1L；
6）1x TBST：10x TBS 100ml加水定容至1L，加入吐温1ml；
7）10% SDS溶液：SDS 10g，在100ml ddH₂0充分溶解，放于室温储存备用；
8）封闭液：脱脂奶粉5g，加入100ml 1x TBST溶解完全，配制成5%的封闭用牛奶。

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二、蛋白样品制备

细胞总蛋白的提取

1）倒掉培养液，用移液枪吸干培养液；

2）每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS洗涤细胞，左右轻轻摇晃后弃去PBS。重复洗涤细胞三次；

3）按1ml RIPA裂解液加10ul PMSF（100mM），摇匀置于冰上；

4）每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动；

5）裂解完后，用细胞刮片将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中；

6）于4℃下12000rpm离心5min（提前开离心机预冷）；

7）将离心后的上清分装至离心管中放于－20℃保存。

三、 蛋白含量的测定

制作标准曲线和检测样品蛋白含量

推荐Absin BCA蛋白定量试剂盒（），按说明书步骤严格进行实验。

四、SDS－PAGE电泳

制胶

按顺序加溶液制备分离胶，每加完一个溶液摇晃均匀，分离胶配好后用水封住，聚合至少需要40min。然后加入浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡，聚合需要30min，拔梳子时尽量避免拔歪。以上是传统的制胶方法，不仅耗时而且耗力，在此推荐Absin的预制胶产品，帮您节约时间。

产品特点：

1）采用自动化的灌胶生产技术，确保了产品质量的高稳定性和重复性；
2）采用玻璃胶板，有效减少蛋白非特异性吸附，使蛋白条带更为敏锐，清晰；
3）胶夹打开极为轻松，只需用刀片在胶夹一侧轻轻划一下即可打开；
4）凝胶中不含SDS，可用于变性和非变性电泳；
5）兼容市场上主流的mini电泳槽，如Bio-Rad, Invitrogen, 天能和君意东方等；
6）本产品电泳时间短。本预制胶推荐的电泳电压和电泳时间为150V 40-50min，即可完成电泳并获得非常平整和锐利的电泳条带。

五、上样和电泳

1）样品准备：95℃加热蛋白10min，快速震荡离心，晾至室温；
2）将胶板组装在电泳仪器上，注意短的玻璃板朝电泳槽内放置，要对齐夹紧不能漏水；
3）将电泳液从电泳槽中开始加入，直至整个仪器全部充满电泳液；
4）按照方案将蛋白和marker打入上样孔中，marker 3ul即可；
5）盖上盖子，注意不要弄错方向，连接电源；150V 40-50min，即可完成电泳。

六、电转

1）PVDF膜需要在甲醇中激活；
2）电泳结束后将胶板取出，短玻璃板朝上放置，揭开短玻璃板后切除多余的胶，在水中将胶从长玻璃板上取下；
3）在电转液中，转膜夹黑色面朝下，依次放置石棉网-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-石棉网，夹紧转膜夹，注意PVDF膜要与胶贴合，排走气泡。调整转膜夹黑色界面转向转膜槽负极，白色面朝向转膜槽正极。灌满电转液后，用200mA恒定电流转膜120min（具体条件自行探索）转膜槽外周装满冰块。

七、封闭

1）将膜取出后，应观察到marker完全从胶转移至膜上；
2）用TBST快速清洗掉膜上残留的电转液；
3）将PVDF膜浸泡在5%封闭牛奶中，缓慢摇荡，室温育1h。

八、抗体孵育和化学发光成像

1）封闭结束后，用1x TBST缓冲液洗掉多余的牛奶，洗膜每次5min，共3次。一抗使用一抗稀释液或TBST按照1:5000稀释（具体条件自行摸索）使用，然后将膜浸泡在一抗中，于4C冰箱中摇床解育过夜；
2）一抗孵育后并回收，加入1x TBST缓冲液放置于摇床上快摇5min，共3次。使用5%脱脂牛奶按照1:1000稀释二抗，室温慢摇1h；
3）二抗孵育完毕后，回收二抗，1x TBST快洗5min，共3次；
4）洗膜结束后，将发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集并使用image J分析灰度。

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