类器官RNA和蛋白提取方法

很多老师咨询类器官RNA和蛋白如何提取，其实类器官可以按微小组织进行RNA和蛋白提取，今天小爱给大家讲一讲提取方法。

类器官蛋白提取方法

一、试剂准备（细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒(abs9346)）

1、准备溶液

1）室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后除结构蛋白提取液外，其他试剂立即置于冰上；

2）结构蛋白提取液溶解后，可放置于37℃水浴中温浴至透明后，常温放置。

2、蛋白提取工作液的准备

1）胞浆蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

2）胞核蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

3）膜蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF；

4）结构蛋白提取工作液的制备：临用前，根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

二、类器官收集及洗涤

移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬，300g ，4℃，离心5min弃上清。

三、类器官蛋白提取

1、胞浆蛋白提取

1）向含类器官沉淀的EP中加入2mL的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡20min；

2）准备1-5mL的注射器，用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次，在4℃条件下，15000g离心10min。取上清液存于EP管中，即为胞浆蛋白。

2、胞核蛋白的提取

取3.1.2步骤获得的沉淀物加入4mL冰浴的胞浆蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，弃去上清液，沉淀物中加入1mL冰冻的胞核蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞核蛋白，转入EP管并保存。

3、胞膜蛋白的提取

在步骤3.2中的沉淀物中加入1mL冰冻的膜蛋白提取工作液，在4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，上清液为细胞膜蛋白，转入EP管并保存。

4、结构蛋白的提取

在步骤3.3的沉淀物中加入常温或37℃水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5mL，4℃条件下震荡5min，4℃条件下15000g离心10min，保存上清液即为细胞骨架蛋白。

5、待测蛋白的保存待检测浓度的蛋白存于-70℃，可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

类器官RNA提取方法

一、类器官收集及洗涤

移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液(abs9730)，轻柔吹打基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组），4℃静置10min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化），300g ，4℃， 离心5min弃上清。

添加1mL类器官传代培养缓冲液重悬，转移到1.5mL EP管，300g ，4℃，离心5min弃上清。

二、类器官RNA提取（超纯总RNA快速提取试剂盒(含DNase I)，货号abs60026）

1、向含类器官沉淀的EP中加入1mL的RL（试剂盒组分）溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀，使RL充分和类器官接触裂解细胞并灭活RNA酶；
2、将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解；
3、每1mL RL加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15sec并将其在室温下孵育3min；
4、于4℃，12000 rpm离心10min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
5、加入1倍体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管内）；
6、12000 rpm 离心45sec，弃废液，将吸附柱重新套回收集管；
7、加400μL去蛋白液RE，12000 rpm 离心45sec，弃废液；
8、DNase I工作液的配制：取10μL DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μL RDD溶液，轻柔混匀；
9、向吸附柱RA中央加入80μL DNase I工作液，室温放置15min（一般情况下室温放置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在37℃放置15min）；
10、加400μL去蛋白液RE，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
11、加入500μL漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000 rpm离心45sec， 弃掉废液；
12、加入500μL漂洗液RW，12000 rpm 离心45sec，弃掉废液；
13、将吸附柱RA放回空收集管中，12000 rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
14、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量往吸附膜的中间部位加50-80μL RNase free H₂O（事先在 65℃水浴中加热效果更好），室温放置2min，12000 rpm 离心1min，所得溶液即为RNA溶液。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min。

提取得到的RNA溶液，可以直接应用于Northern 杂交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA文库构建、体外翻译等各种常规分子生物学实验。

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

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