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本期分子小课堂 | 常规PCR技术介绍

2023-11-24

PCR技术的前世今生

 

科学家对核酸的研究已有100多年历史,20世纪70年代初人们就致力于研究基因的分离技术。Khorana等于1971年最早提出核酸体外扩增理念:DNA变性解链后与相应引物杂交,用DNA聚合酶延伸,重复该过程便可以克隆基因[1]因为当时的技术尚未成熟,该设想一直未被证实。

 

直到在1985年,Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功(发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了后期的诺贝尔化学奖)。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR技术,使扩增反应的特异性和效率大大提高,并简化了操作程序,最终实现DNA扩增的自动化,迅速推动了PCR的应用和普及[2]。随着技术不断改进,PCR技术已被广泛应用于医学、农学、植物病理学等研究领域。它从一种定性的分析方法发展到定量测定,也从原先只扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。

 

PCR技术原理

 

PCR技术(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。反应的基本成分包括模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

 

PCR技术的基本原理,类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR技术主要包含以下几个过程:

 

1)模板DNA变性:模板DNA经94℃加热一定时间后,使模板DNA双链解离形成单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备;
2)模板DNA与引物退火(复性):模板DNA经加热变性形成单链后,温度下降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3)引物的延伸:DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶作用下,在72℃左右,以dNTPs为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原则,合成一条新链。新合成的子链又重复循环变性——退火——延伸三个过程,以获得更多的新链。每个循环需要2-4min,2-3h就能将待扩增的目的基因扩增放大几百倍。

 


 

注:图片来源于网络,如有侵权请联系删除

 

PCR的种类

 

到目前为止,PCR技术发展出十几种之多,本次小爱给大家科普下几种常用的PCR。

 

1、普通PCR

 

就是我们实验室最常用的PCR,技术原理如上所述。普通PCR技术是分子生物实验的基础,可以用于基因的分离、克隆和核酸序列分析等基础性研究,定性判断核酸含量;同时用于疾病的诊断或任何与DNA、RNA相关的检测应用。下面以一个实验为例介绍普通PCR的常规操作步骤:

 

实验所需试剂及耗材设备:

 

模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶(5U/uL)、包含15mmol/L Mg2+的Buffer、ddH2O、PCR仪、移液枪、PCR板、吸头

 

实验步骤:


1)配置PCR反应体系:

在PCR反应板中依次加入下列溶液:

模板DNA 2uL;上游引物1uL;下游引物1uL;dNTPs  1.5uL;Tag酶0.5uL;ddH2O 使总体系达到20uL。

 

2)设置PCR反应程序:

94℃ 3min;94℃ 45s;55℃ 45s;72℃ 45s;72℃ 5min;4℃ 1h


3)上样,启动反应程序;


4)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

 

爱必信拥有包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液的PCR反应液,具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可最大限度的减少人为误差。使用时只需加入DNA模板和引物既可。

 

货号

产品名称

规格

abs60036

2×Taq PCR Mix

1mL×5

abs60037

2×Taq PCR Master Mix(for PAGE)

1mL

 

2、热启动PCR

 

热启动PCR(Hot Start PCR)是指它的Taq DNA聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR,可提高反应的特异性。Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。PCR反应的最初加热过程中,样品温度上升到70℃之前,在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合,并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸,结果会导致非靶序列的扩增,影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增,提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限,如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作等情况,热启动PCR尤为有效。爱必信热启动PCR相关试剂如下:

 

货号

产品名称

规格

abs60032

2×HotStart Taq PCR Mix with Loading Dye

1mL

abs60033

2×HotStart Taq PCR Mix Loading Dye-free

1mL

abs60057

2×HotStart Taq plus Master Mix(Quick Load)

1mL

 

3、高保真PCR

 

高保真PCR主要依赖于高保真酶。普通Taq酶具有5'→3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性,缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。而高保真酶具有极强的校对功能,其保真度比普通Taq酶高50倍,远高于其他同类酶。因此高保真PCR特别适用于质粒构建等实验。爱必信高保真PCR相关试剂如下:

 

货号

产品名称

规格

abs60034

2×Xerox PCR Master Mix

1mL

abs60055

2×Pfu Master Mix(Quick Load)

1mL

abs60056

2×Pfu Master Mix

1mL

abs44072245

Pfu DNA Polymerase

100IU

 

4、长片段扩增

 

Taq DNA聚合酶在扩增长度超过4kb的PCR产物时通常会失败,原因包括非特异性引物退火、DNA模板中的二级结构和次优循环条件——所有这些因素对较长的PCR产物的扩增比对较短的PCR产物有更大的影响。在长程PCR中,防止DNA损失特别重要,因为模板内的单个DNA损伤足以使PCR酶停滞。PCR循环过程中的DNA损伤可以通过稳定反应pH的特定缓冲物质最小化。商业PCR试剂盒是专门为克服长程PCR的挑战而设计的。

 

货号

产品名称

规格

abs60035

2×Long Taq PCR Master Mix

1mL

abs60061

2×Fast Pfu Master Mix(Quick Load)

1mL

abs60062

2×Fast Pfu Master Mix

1mL


参考文献:

[1] 黄留玉.PCR最新技术原理,方法及应用[M].化学工业出版社,2005.

[2] 邓小红,任海芳.PCR技术详解及分析[J].重庆工商大学学报(自然科学版), 2007, 24(1):29-33.DOI:10.3969/j.issn.1672-058X.2007.01.009.

[3] 粟玉刚,程天印,董欢.热启动PCR技术的研究进展[J].畜牧兽医科技信息, 2009(3):2.DOI:10.3969/j.issn.1671-6027.2009.03.004.



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WB相关:ECL发光液、预染marker、预制胶;IHC相关:二抗试剂盒、组化笔;IP/CoIP试剂盒;激动剂/抑制剂;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡试剂盒;呼吸爆发试剂盒;ELISA试剂盒;重组蛋白;抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体;定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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