本期分子小课堂 | 常规PCR技术介绍

PCR技术的前世今生

科学家对核酸的研究已有100多年历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的分离技术。Khorana等于1971年最早提出核酸体外扩增理念：DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸，重复该过程便可以克隆基因^[1]。因为当时的技术尚未成熟，该设想一直未被证实。

直到在1985年，Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功（发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了后期的诺贝尔化学奖）。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq酶）引入PCR技术，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及^[2]。随着技术不断改进，PCR技术已被广泛应用于医学、农学、植物病理学等研究领域。它从一种定性的分析方法发展到定量测定，也从原先只扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。

PCR技术原理

PCR技术(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，指在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。反应的基本成分包括模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

PCR技术的基本原理，类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR技术主要包含以下几个过程：

1）模板DNA变性：模板DNA经94℃加热一定时间后，使模板DNA双链解离形成单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
2）模板DNA与引物退火（复性）：模板DNA经加热变性形成单链后，温度下降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3）引物的延伸：DNA模板—引物结合物在Taq DNA聚合酶作用下，在72℃左右，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原则，合成一条新链。新合成的子链又重复循环变性——退火——延伸三个过程，以获得更多的新链。每个循环需要2-4min，2-3h就能将待扩增的目的基因扩增放大几百倍。

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PCR的种类

到目前为止，PCR技术发展出十几种之多，本次小爱给大家科普下几种常用的PCR。

1、普通PCR

就是我们实验室最常用的PCR，技术原理如上所述。普通PCR技术是分子生物实验的基础，可以用于基因的分离、克隆和核酸序列分析等基础性研究，定性判断核酸含量；同时用于疾病的诊断或任何与DNA、RNA相关的检测应用。下面以一个实验为例介绍普通PCR的常规操作步骤：

实验所需试剂及耗材设备：

模板DNA、引物、Taq DNA聚合酶(5U/uL)、包含15mmol/L Mg²⁺的Buffer、ddH₂O、PCR仪、移液枪、PCR板、吸头

实验步骤：

1）配置PCR反应体系：

在PCR反应板中依次加入下列溶液：

模板DNA 2uL；上游引物1uL；下游引物1uL；dNTPs  1.5uL；Tag酶0.5uL；ddH₂O 使总体系达到20uL。

2）设置PCR反应程序：

94℃ 3min；94℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 45s；72℃ 5min；4℃ 1h

3）上样，启动反应程序；

4）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

爱必信拥有包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液的PCR反应液，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。使用时只需加入DNA模板和引物既可。

2、热启动PCR

热启动PCR(Hot Start PCR)是指它的Taq DNA聚合酶只有在样品温度至少超过70℃时才发挥作用的PCR，可提高反应的特异性。Taq DNA聚合酶通常在比适宜温度低得多的条件下仍有较强的活性。PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致非靶序列的扩增，影响反应的特异性。热启动可减少非靶序列的扩增，提高反应的特异性。在引物设计时如果某位点因为遗传元件的定位而受限，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作等情况，热启动PCR尤为有效。爱必信热启动PCR相关试剂如下：

3、高保真PCR

高保真PCR主要依赖于高保真酶。普通Taq酶具有5'→3'DNA聚合酶活性和5'→3'的外切酶活性，缺少3'→5'的外切酶活性因而在合成中对某些单核苷酸错配没有校正功能。而高保真酶具有极强的校对功能，其保真度比普通Taq酶高50倍，远高于其他同类酶。因此高保真PCR特别适用于质粒构建等实验。爱必信高保真PCR相关试剂如下：

4、长片段扩增

Taq DNA聚合酶在扩增长度超过4kb的PCR产物时通常会失败，原因包括非特异性引物退火、DNA模板中的二级结构和次优循环条件——所有这些因素对较长的PCR产物的扩增比对较短的PCR产物有更大的影响。在长程PCR中，防止DNA损失特别重要，因为模板内的单个DNA损伤足以使PCR酶停滞。PCR循环过程中的DNA损伤可以通过稳定反应pH的特定缓冲物质最小化。商业PCR试剂盒是专门为克服长程PCR的挑战而设计的。

参考文献：

[1] 黄留玉.PCR最新技术原理,方法及应用[M].化学工业出版社,2005.

[2] 邓小红,任海芳.PCR技术详解及分析[J].重庆工商大学学报(自然科学版), 2007, 24(1):29-33.DOI:10.3969/j.issn.1672-058X.2007.01.009.

[3] 粟玉刚,程天印,董欢.热启动PCR技术的研究进展[J].畜牧兽医科技信息, 2009(3):2.DOI:10.3969/j.issn.1671-6027.2009.03.004.

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