生化检测试剂盒 | 羟脯氨酸检测与肺纤维化严重程度评估

2023-12-21

背景介绍：

羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）是蛋白质和多肽前体的重要组成部分，是一种游离氨基酸，在体内没有代谢途径，主要以原型经尿排出，其生理功能与赖氨酸类似，都是构成氨基酸的一种重要成分。羟脯氨酸在体内具有多种生物学功能，与体内许多重要的生理活动和病理变化密切相关，在哺乳动物中，它仅存在于胶原蛋白和弹性蛋白中，但在植物中，许多蛋白质都含有羟脯氨酸。人体中含有大量羟脯氨酸，它既是合成蛋白质的原料，又是合成抗体和细胞因子等物质的前体，多种疾病如肿瘤、炎症等都会影响胶原蛋白更新，并可能导致血清或尿液羟脯氨酸升高。

羟脯氨酸检测在肺纤维化中的应用：

各项研究指示，胶原蛋白的过度沉积是纤维化疾病的主要特征，而羟脯氨酸（HYP）作为胶原蛋白所特有的一种氨基酸，其含量约占胶原蛋白总氨基酸的13%，因此，采用比色法、 HPLC等生化方法测定组织中羟脯氨酸的总含量逐渐成为纤维化严重程度评价最常用的方法学，在2017年该方法学更是被美国胸科协会指南确立为肺纤维化临床前评价的“金标准”。

2023年3月，中国科学技术大学基础医学院陈永艳副教授团队在Immunity & Ageing期刊上发表了题为“UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fbrosis”的研究论文。本研究主要探讨了老化的肺部容易受到慢性肺部疾病的影响，发现老化的呼吸道上皮细胞显著上调子宫球蛋白相关蛋白1（UGRP1）的表达，从而导致衰老肺中CCL6水平升高，而肺泡巨噬细胞（AM）随着衰老而发生本质变化，表现出细胞数量减少和基因表达改变；UGRP1和MARCO+AM的上调参与了肺纤维化的进展。因此UGRP1以CCL6依赖的方式调制与年龄相关的肺纤维化的MARCO⁺AM，是为老龄化人群建立最佳靶向的关键。

图运用羟脯氨酸含量检测试剂盒abs580066对肺组织进行检测

羟脯氨酸含量检测试剂盒：

试剂盒组分	规格	储存条件
96-Well Microplate	1 plate	常温
Substrate	Powder x 1	4℃，避光保存
Substrate Diluent	8 mL x 1	4℃，避光保存
Stop Solution	4 mL x 1	4℃
Dye Reagent	Powder x 1	4℃，避光保存
Dye Reagent Diluent	4 mL x 1	4℃
Standard	Powder x 1	4℃
Plate Adhesive Strips	3 Strips	常温

另需自备的材料：酶标仪（可读取560nm处的吸光度）、蒸馏水、移液器与枪头、研钵、离心机、高压灭菌器、6mol/L HCl、10mol/L NaOH、酒精等。

操作步骤（以组织样本为例）：

1、样本处理：称取1g组织于玻璃管中，加入1mL 6mol/L HCl，放入110℃烘箱中6~12h，离心机16000g 25℃离心20min，取上清液至新离心管中，然后加10mol/L NaOH调节pH至7.0。

2、试剂准备：

1）Substrate：加入8mL Substrate Diluent溶解。（现配现用）
2）Dye Reagent：加入4mL Dye Reagent Diluent溶解。（现配现用）
3）标准品：加入1mL蒸馏水溶解Standard得到Standard①；从Standard①取10μL加入990μL蒸馏水中得到Standard②；取200μL Standard②加入800μL蒸馏水中，制备得到浓度为200μmol/L的Standard。

标准品二倍连续稀释示例

3、上样：
1）分别将40uL不同浓度的标准品、样品加入相应孔中，另设置空白孔加入40uL蒸馏水；
2）每孔分别加入80uL Substrate，混合均匀，室温孵育20min；
3）每孔分别加入40uL Stop Solution，混合均匀，室温孵育10min；
4）每孔分别加入40uL Dye Reagent，混合均匀，放入65℃烘箱中反应20min，冷却至室温。

试剂	标准品孔	样品孔	空白孔
标准品	40uL	--	--
样品	--	40uL	--
蒸馏水	--	--	40uL
Substrate	80uL	80uL	80uL
混合均匀，室温孵育20min
Stop Solution	40uL	40uL	40uL
混合均匀，室温孵育10min
Dye Reagent	40uL	40uL	40uL
混合均匀，放入65℃烘箱中反应20min，冷却至室温

4、检测与计算：使用酶标仪测量560nm处的吸光度，拟合标准曲线并计算样本浓度

注意事项：

1）对于未知的样品，建议多做几个稀释梯度进行预实验，确保读数在标准曲线范围内；
2）试剂盒中的试剂需要现配现用，配好的溶液无法储存，可能影响显色读数进而影响检测；如果样本需要分批检测，建议分批收样储存，待样本收齐后统一检测；
3）每次实验必须重新检测并绘制标准曲线。

Absin生化检测试剂盒——氨基酸代谢系列：

货号	品名	用途
abs580002	Alanine Transaminase Microplate Assay Kit	谷丙转氨酶（ALT）检测
abs580004	Aspartate Transaminase Microplate Assay Kit	谷草转氨酶（AST）检测
abs580005	Glutamate Microplate Assay Kit	谷氨酸（Glu）检测
abs580063	Glutamate Synthase Microplate Assay Kit	谷氨酸合成酶（GOGAT）检测
abs580064	Glutaminase Microplate Assay Kit	谷氨酰胺酶（GLS）检测
abs580066	Hydroxyproline Microplate Assay Kit	羟脯氨酸（HYP）检测
abs580116	Arginase Microplate Assay Kit	精氨酸酶检测
abs580184	Lysine Microplate Assay Kit	赖氨酸（LYS）检测
abs580118	Proline Microplate Assay Kit	脯氨酸（PRO）检测
abs580127	Cysteine Microplate Assay Kit	半胱氨酸（Cys）检测
abs580187	Total Amino Acid Microplate Assay Kit	氨基酸（AA）检测
abs580157	Acetolactate Synthase Microplate Assay Kit	乙酰乳酸合成酶/乙酰羟酸合酶（ALS）检测

引用文献：

Chen Y, Hao X, Li M, Tian Z, Cheng M. UGRP1-modulated MARCO+ alveolar macrophages contribute to age-related lung fibrosis. Immun Ageing. 2023 Mar 18;20(1):14. doi: 10.1186/s12979-023-00338-8. PMID: 36934284; PMCID: PMC10024420.

Absin特色产品线：

WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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