疑难样本 | FFPE样本核酸提取指南

什么是FFPE样本？

FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded，福尔马林固定石蜡包埋) 样本是将细胞、组织等放到固定液中，将固定后的细胞、组织置入由液体石蜡填充的容器中进行保存的样本，这样处理能够较长时间地保持细胞病理的原始状态。

FFPE样本可以用于常规的组织学分析，也可用于分子细胞的基因表达分析。FFPE样本的基因检测，指的就是利用FFPE样本通过蒸馏、消化、DNA/RNA提取等细胞、组织分子技术，对样本中DNA及RNA进行检测，以获取相关基因表达在细胞进行特定组织及生物过程中的功能及表型特征，为基因组学研究及深入了解肿瘤等领域研究具有很大的参考价值和应用场景价值。

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FFPE样本制备及核酸提取流程

图 FFPE样本制备及核酸提取纯化流程图

1、样本采集

快速从病人身上获取组织样本。为避免组织离体后在外界环境中可能发生基因改变、组织自溶等变化，组织从获取到固定之间的时间间隔控制得越短越好。

2、组织固定

将获得的组织置于一定浓度（一般是10%）的福尔马林溶液中。福尔马林的作用是用于组织固定，这个过程会使蛋白质之间、核酸之间、蛋白质和核酸之间发生一定程度的交联。此过程要注意把握组织的厚度，固定的时间。

3、石蜡包埋

将组织用石蜡进行包埋。此过程包含：
1）脱水，使用醇类替换水；
2）透明，使用二甲苯替换掉醇类；
3）浸蜡，将组织浸入石蜡中，利用石蜡替换掉二甲苯；
4）包埋，将渗透后的组织样本浸泡在液态石蜡中，连同包埋模具一起冰冷后固化，再切割为薄片后成为固定石蜡样本，可长期保存或进行下游实验。

4、核酸提取

FFPE样本核酸提取的通用步骤为脱蜡、裂解-解交联、纯化、回收。具体步骤参照不同试剂盒说明书进行操作。

1）脱蜡

用手术刀片刮取玻片上的样本至取样管中，加入去蜡剂（环保浸蜡脱蜡透明液，abs9791）或二甲苯，在一定温度中孵育进行脱蜡暴露组织。

2）裂解-解交联

利用裂解液与蛋白酶在一定温度下进行组织裂解与解交联。

3）核酸纯化

采用不同核酸纯化方法纯化DNA或者RNA。

4）回收核酸

利用洗脱液回收核酸。

图 FFPE样本核酸纯化步骤

下面以爱必信的石蜡组织基因组DNA快速提取试剂盒(abs60019)为例具体介绍FFPE样本DNA提取纯化步骤。

1、产品组分信息：

2、自备材料

无水乙醇（第一次使用前请先在漂洗液 WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀）、2mL EP管、水浴锅、离心机、涡旋仪

3、实验步骤

1）将组织切片4-5片，装入到2mL EP管中，加入1.5mL SLI液，充分振荡；
2）65℃水浴30min，再次充分混匀，12000rpm，4℃离心15min；
3）弃上清，再加入1mL SLI液，按以上步骤重复2-3次；
4）沉淀（组织）加入200μL裂解液TL和1mL SLⅡ溶液，加入20-50μL蛋白酶K，56℃水浴过夜；
5）观察组织消化情况，如还有组织未完全消化，加入10-20μL蛋白酶K，56℃水浴10-20min或直至组织消化完全（期间可用涡旋充分振荡混匀加速组织消化）；

注：也可用二甲苯进行脱蜡，所需试剂需自备，具体操作步骤也可参考本试剂盒说明书—脱蜡方法二。

6）加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min；
7）冷却后加入200μL无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀；
8）将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
9）加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30sec，弃废液；
10）加入500μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），12000rpm离心30sec，弃掉废液；
11）重复操作步骤10；
12）将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
13）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-100μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65℃水浴中预热效果更好），室温放置3-5min，12000rpm离心1min。为了增加DNA的回收率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
注：DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

5、核酸质控检测

对于从FFPE样本中提取的核酸，一般通过吸光度检测仪器Nanodrop，荧光定量仪Qubit及毛细管电泳仪进行测定核酸浓度、OD值（纯度）及片段大小(DIN)。对于核酸的质控是非常重要的，因为提取的核酸质量会影响下游的实验结果。

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参考文献：

[1] Klopfleisch R, Weiss AT, Gruber AD. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol Histopathol. 2011 Jun;26(6):797-810. doi: 10.14670/HH-26.797. PMID: 21472693.

[2] 裴永彬,贺新奇,赵增仁.石蜡包埋组织中DNA提取技术研究进展[J].河北医科大学学报,2010,31(11):1396-1399.

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