免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP) 磁珠法VS琼脂糖珠法

免疫 (共) 沉淀 (IP/CoIP)

是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用，通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体，进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白，同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子的一种技术。

琼脂糖珠VS磁珠

琼脂糖珠作为免疫沉淀实验中的固相支持物已经历经多年，随着实验技术的发展，磁珠开始大幅取代琼脂糖珠，成为免疫沉淀纯化方法的首先选择，许多刚接触的研究者都要面临方法选择的问题，磁珠法VS琼脂糖珠法，区别在哪里？分别有什么优缺点？

图1 琼脂糖珠结构

图2 磁珠

区别：

1、抗体结合量：琼脂糖珠（直径50-150μm）明显大于磁珠（直径1-4μm），所以单个琼脂糖珠结合抗体的量大于磁珠，但是磁珠每体积的磁珠比琼脂糖珠的量多；
2、结合能力：琼脂糖珠是多孔的海绵状结果，与抗体的结合能力优于磁珠；
3、非特异性结合：琼脂糖珠的非特异性结合比磁珠多，样品中的非目的蛋白或者抗体的任何部位都可能与之结合，所以在琼脂糖珠法中，样品的预处理非常重要；
4、抗体的损耗：琼脂糖珠大于磁珠，由于琼脂糖珠的多孔结构，抗体很容易被困其中，并且，离心洗涤的过程中很容易流失；
5、实验时间：磁珠法可室温短时间孵育（仅限Absin abs9649和abs955的比较）；
6、特殊设备：磁珠法需要自备磁力架。

abs9649（磁珠法）和abs955（琼脂糖珠法）常见问题：

图 abs9649免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒(磁珠法)

图 abs955免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒

以下问题仅针对爱必信现有两款试剂盒abs9649和abs955

一、样品处理

1、两个试剂盒中lysis buffer都要添加PMSF吗，怎么使用？

两个试剂盒中的PMSF都要额外准备，推荐abs9146，根据使用量，取每1mL lysis buffer加入10ul PMSF（100mM，溶解174mg的abs9146于足量的异丙醇中，定容到10mL，分装成小份贮存于-20℃。）使PMSF的最终浓度为1mM，混匀备用 （PMSF现用现加）。磁珠法缓冲液请按说明书配置后使用，buffer稀释均可用超纯水。

2、abs9649如果没有超声破碎仪的话，能不能用酶解的办法破碎细胞？

酶解和超声都可以，酶按照实验室正常使用浓度配制即可。

3、蛋白的量如何估算？

可以使用BCA蛋白定量试剂盒(abs9232)。

4、如果我的细胞裂解物里面蛋白含量高于试剂盒要求的总蛋白含量，我应该用什么试剂进行稀释呢？

常规用PBS稀释即可。

二、如何减轻琼脂糖珠非特异性吸附？

可以通过多次洗涤，和样品预处理（适当延长Protein A和Protein G的孵育时间）来降低背景，但应注意，选择此步骤后，试剂盒中protein A和protein G对应实验样本数减半。

三、结合过程中，4℃混合过夜孵育可用什么仪器？

可以用混合仪abs72030或abs72019。

图 abs72019旋转混合仪(XHE-100)

四、abs955中beads出现吸不出来的情况，怎么处理？

吸之前需注意枪头要剪一下再吸，如若beads吸不上来，可加入等体积的20%乙醇混匀后再吸。

五、如果我后续是想要跑native胶，不做变性电泳，如何选择样品缓冲液？

用不含有SDS的WB上样缓冲液，但不经过变性，蛋白能否解离下来，我们无法确定，不能保证您后续的实验效果。

六、磁珠法两种洗脱方案的区别？

两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原，低pH 洗脱样本中抗体为完整结构，变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链，请根据后续实验需求选择洗脱方案。

*文中图片来源于网络，仅供学习参考用

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