微生物平板计数法和流式检测法介绍

2024-03-08

食品安全的重要性不言而喻，而微生物检测是食品安全检验的重要组成部分。在进行微生物检测时，首先要根据其性质和特点，选择适合的微生物检验方法，同时还要明确食品的污染状况、危害程度以及具体的检验项目和要求。

微生物检测方法包括常规检测法（如平板计数法、涂片镜检、分离培养、生化试验、血清学试验等）、免疫学方法、分子生物学方法、代谢学技术等。本期小爱向大家介绍2种常用的微生物检测方法：平板计数法和流式检测法。

1、平板计数法

微生物平板计数常用3种培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 (Gause)Ⅰ号培养基和Martin琼脂培养基。针对食品微生物检测常用培养基的配制，应当根据不同检验目的，选择不同的配制材料，常见的培养基材料配比如表1。在实际食品微生物检验过程中，根据不同的需要对配制材料进行选择。

牛肉膏蛋白胨培养基：主要用于食品微生物中细菌的培养。为保证培养基的质量，需要在125℃环境下持续进行15min的灭菌处理。

高氏 (Gause)Ⅰ号培养基：主要用于放线菌的培养。在配制的过程中，首先应当在淀粉中添加少量的冷水，通过搅拌得到糊状淀粉后，再将其倒入100℃的水中，然后加热并加入其余配制材料搅拌至溶化。配制后同样需要在125℃环境下持续进行15min的灭菌处理。

Martin琼脂培养基：主要用于微生物中真菌的分离，完成灭菌处理后，在使用前加入0.02%链霉素稀释液，通常为100~150mL，保证每毫升培养基当中均含有25μg链霉素。

表1 73种常用培养基材料配比^[1]

培养基名称	配制材料
牛肉膏蛋白胨培养基	牛肉膏(3.5g)、蛋白胨(5.5g)、氯化钠(11g)、瓜尔豆胶(13~21g)、PH(7.0~7.3)、水(1500mL)
高氏 (Gause) Ⅰ号培养基	可溶性淀粉(15g)、硝酸钾(1.5g)、磷酸氢二钾(0.25g)、硫酸镁(0.25g)、琼脂粉(15g)、磷酸氢二钾(0.25g)、硫酸镁(0.25g)、PH(7.0~7.3)、水(1500mL)
Martin琼脂培养基	葡萄糖(11.5g)、蛋白胨(4.5g)、磷酸二氢钾(0.85g)、七水合硫酸镁(0.25g)、1/2000孟加拉红(120mL)、瓜尔胶(11~25g)、PH(自然)、蒸馏水(750mL)

然而，平板计数法时效性不足、难以区分死活、无法检测非培养性微生物。微生物活的非可培养 (Viable but non-culturable，VBNC) 状态（图1）给平板计数法带来了挑战，同时也吸引了越来越多学者的关注。流式细胞术可解决平板计数法检测不到VBNC状态菌的问题。

图1 VBNC状态的形成与复苏

2 、流式检测法

微生物的流式细胞仪检测也是科学研究中比较常用的检测技术。与真核生物细胞相比，细菌等微生物的体积较小，其散射光难以与其他物质的颗粒区分。因此，通过流式细胞仪的检测依赖于与细胞结合的荧光染料，用于从背景中识别真正的目标物。

A：液流系统；B：光源系统；C：检测和计算、分析系统

图2 流式细胞仪的组成及工作原理^[2]

根据荧光底物的不同，适用于流式检测法的荧光染料主要包括：结合核酸的染料，如PI、7-AAD；标记抗体蛋白的染料，如Cy5、FITC、PE。不同的荧光染料具有不同的激发波长和发射波长。流式细胞仪通常会配备多个激光器，如405nm、488nm、633nm 等。多激光器可实现多荧光通道分析，减少自发荧光干扰、减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度。

表2 微生物流式检测常用染料

染料名称	被标记物	标记特点	激光器
PI	DNA	与DNA结合，几乎无序列偏好。不能透过活细胞的细胞膜，用于群体中死细胞检测	488nm氩离子激光器
7-AAD	DNA	可用于替代PI，在与PE或FITC的双色分析中减少波长之间的光谱重叠	488nm氩离子激光器
Cy5	DNA、蛋白	常用于标记寡核苷酸、蛋白抗体	633nm氦氖激光器
FITC	蛋白	应用最广泛的荧光素类标记，标记蛋白抗体	488nm氩离子激光器
PE	蛋白	标记蛋白抗体，与FITC同染时需要扣除荧光补偿	488nm氩离子激光器

另外，流式细胞术荧光标记的选择还需考虑仪器配置的光源波长、染料的亮度与靶标表达量的匹配、染料光谱重叠和样本自发荧光等多重因素。

3、7-AAD流式检测原理及方法

7-AAD是一种核酸染料，它在细胞凋亡和细胞死亡过程中会被释放出来。当细胞开始凋亡时，其质膜对7-AAD的通透性会逐渐增加。在特定的波长激发下，7-AAD可以发出明亮的红色荧光。通过这种荧光的强度，可以将细胞分为三个群体：7-AAD信号强的代表死亡细胞，7-AAD信号弱的则是处于凋亡状态的细胞，而没有检测到7-AAD信号的是正常活力的细胞。

该操作步骤适用于大多数细胞，但不同的细胞类型、细胞密度、使用的培养基以及其他一些因素都有可能影响染色效果以下步骤仅供参考。

1）储存液的制备：取适量DMSO加入到7-AAD原瓶中配制成1-10mM储存液，分装保存于-20℃，可稳定保存6个月；
2）根据自身样本选择合适的步骤固定细胞。7-AAD染色一般在其它染色完成后再进行，且仅仅染色死细胞；
3）离心收集细胞，并用合适的的缓冲盐溶液或者培养基（pH=7.4）重悬细胞；
注：贴壁细胞可在盖玻片或者培养板上进行原位染色。
4）加入适量7-AAD染色液，推荐该染料的工作浓度为0.5-5μM，孵育15-60min；
注：首次实验建议在推荐的工作浓度范围内设置浓度梯度检测，从而摸索最佳的染色浓度。
5）根据其最大激发和发射波长（Ex/Em=545nm/650nm）在流式细胞仪下（FL3通道）检测荧光强度。

图3 用0.25μg/10⁶cells 7-AAD复染，流式检测计算细胞死亡率^[3]

参考文献

[1] 吴芳媛,冯秋芳,林黎.食品微生物检验常用培养基配制,灭菌及贮藏研究[J].食品安全导刊, 2020(36):1.
[2] 高惠敏,颜春荣,徐春祥,等.食品微生物检验中流式细胞术的研究进展[J].生物灾害科学, 2023, 46(4): 549-556.
[3] Tian X X, Nanding K, Dai X Y, et al. Pattern recognition receptor mediated innate immune response requires a Rif-dependent pathway[J]. Journal of Autoimmunity, 134 (2023) 102975. 影响因子：14.511

微生物培养基原料：

货号	品名	规格
abs42219719	琼脂粉	500g
abs44077794	酵母浸粉	250g
abs47014867	胰蛋白胨	500g
abs47047439	酸水解酪蛋白	1Kg
abs47048257	胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)	250g
abs47048258	营养肉汤(NB)培养基	250g
abs47048259	牛肉浸粉	250g
abs47048260	牛肉浸膏	500g
abs47048261	肉汤培养基粉剂(CM)	1L
abs47048279	LB肉汤(Lennox)	250g
abs47048280	LB肉汤(Miller)	250g
abs47048281	LB营养琼脂(Miller)	250g

流式检测常用染料：

货号	品名	规格	λEx(nm)/ λEm(nm)
abs42018594	5-FITC	500mg	494/520
abs45153587	B-PE (B-Phycoerythrin)	1mg	545/578
abs47038465	Sulfo-Cy5-E	1mg	646/661
abs9104	7-AAD	1mg	545/650
abs9358	PI	10mL	535/617

流式检测常用串联染料：

货号	产品名称	规格	λEx(nm)/λEm(nm)
abs47048236	串联染料APC-Cy7	1mg	651/780
abs47048237	串联染料PerCP-Cy5.5	1mg	489/679
abs47048238	串联染料PE-Cy5	1mg	565/670
abs47048239	串联染料APC-Cy5.5	1mg	651/700
abs47048240	串联染料PE-Cy7	1mg	565/780
abs47048241	串联染料PE-Cy5.5	1mg	565/700

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