冰冻切片:
是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便,而多应用于手术中的快速病理诊断,也是组织化学,特别是酶组织化学最常用的切片技术。
图1 冷冻切片机
冰冻切片与石蜡切片对比:
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石蜡切片 |
冷冻切片 |
步骤 |
需要经过固定-脱水-透明-透蜡-包埋等多个步骤,相对比较繁琐 |
只需固定-脱水-包埋,流程简便 |
组织结构 |
保存良好 |
切片易碎烂 |
抗原活性 |
经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理,组织内抗原活性失去较多 |
免疫活性保存良好,尤其是细胞表面抗原 |
抗原修复 |
一定要做 |
可以不做 |
抗原定位 |
准确 |
冰晶容易影响抗原定位 |
连续切片 |
可以 |
较难获取 |
包埋 |
石蜡包埋 |
OCT包埋 |
抗体洗脱(多色) |
热修复和抗体洗脱液均可 |
抗体洗脱液 |
保存时间 |
蜡块能保存1-3年,切片3个月 |
-80℃保存数月 |
切片厚度 |
3-5um |
8um左右 |
运输 |
常温 |
干冰 |
OCT包埋剂的应用:
与石蜡组织相比,冷冻切片的简便快捷使其在临床组织学诊断中应用广泛,特别适用于脂肪组织、神经组织、髓鞘,以及肌肉的活检染色。
OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物,其用途是在冰冻切片时支撑组织,以增加组织的连续性,减少皱折及碎裂。OCT混合物为水溶性,故在漂片时可溶于水,在后续的染色中不会增加背景染色。爱必信的OCT包埋剂限时六折优惠,质量媲美樱花,包埋效果被许多客户肯定!
图2 abs9756-110mL OCT包埋剂
冰冻切片样本制备:
冰冻切片的样本制备较为简单。
方式一:尽量选用新鲜组织,用生理盐水清洗掉表面血水,将组织修剪到一定大小,用吸水纸吸干表面水分(防止水分在速冻过程中形成冰晶),直接进行后续包埋。
方式二:选取新鲜组织,修整到一定大小,至于多聚甲醛中低温固定18-24h,再经过30%的蔗糖沉降脱水(或者梯度脱水,15%蔗糖中脱水至沉底,再转到30%蔗糖中沉底),再经过OCT的包埋。
包埋:提前准备泡沫箱,倒入一定量的液氮,在包埋磨具中加入少量OCT覆盖磨具底部(避免产生气泡,若产生气泡可用注射器或者枪头吸弃),将组织至于OCT包埋剂中,调整组织位置,加入OCT包埋剂完全覆盖组织(避免产生气泡),用镊子夹住磨具,至于液氮上方,大概10-20s后,组织就会迅速的冰结成块,若不能及时切片,用锡纸包裹,做好标记,至于-80℃冰箱内保存。
图3 冰冻切片一次性包埋磨具
许多老师纠结于方案一和方案二的选择,这里给到的建议是,如果是手术中的快速诊断,简单的HE染色,可以用方案一,结果快,但是在追求速度的同时,极大的降低了灵敏度,科研实验或者做多重荧光免疫组化,推荐使用方案二,为的是保证染色时能精确定位,提高特异度和灵敏度。
切片制作:
1、切片前调整冷冻切片机温度在-25℃~-18℃;
2、在标本拖上涂适量包埋剂,将冷冻包埋好的样本取出,至于标本拖上冷冻固定;
3、将样本拖至于冷冻切片机的机头上,调整位置;
4、调整切片厚度进行修片(修片时厚度可以大一些),修整标本至组织块暴露。用毛笔将操作区清扫干净;
5、重新调整切片厚度,进行正式切片,切下的组织片在防卷板下方平铺,可用毛笔辅助组织片平整,用防脱载玻片平稳吸附切片。
注意事项:
1、操作时,玻璃机盖不可打开过大,以免温度变化;
2、载玻片吸附切片之前应置于室温,否则难以吸附;
3、样本拖涂的包埋剂要尽量平整,不可一边高一边低,会影响切面位置。
图4 爱必信组化试剂盒
冰冻切片常见问题及对策:
1、温度对切片的影响
组织块过冷切片时易碎裂或成粉末状,温度不足,组织回软也不能保证切片的完整。
2、切片皱缩或卷缩
可能的原因有:刀片不够锋利、防卷板有异物、防卷板与刀片位置不协调他、包埋剂包埋不完全。
3、切片脱落或吸附性差
可能的原因有:实验前防脱载玻片至于冷冻切片机内,样本中有坏死区域,切片过厚、载破片有异物。
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