类器官原位活死染色实验攻略

概述

在类器官的培养过程中，如果我们想了解类器官的增殖及凋亡状态，可以通过对活细胞和死细胞进行荧光染色，通过荧光显微镜拍照观察。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光 (Ex=490nm, Em=515nm)。因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein-AM细胞毒性极低，是最适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。        

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide, PI)不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535nm, Em=617nm)，因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545nm激发，仅可观察到死细胞。

原理

本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，以24孔板，每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例，每孔添加500uL染色工作液进行染色。

活细胞/死细胞双染试剂盒(abs50056)

实验步骤

一、工作液的配制：

1、1×Assay Buffer（反应缓冲液）的配制 从低温冰箱内取出10×Assay Buffer，根据单次用量无菌条件取出适量，用去离子水(dH₂O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

2、1×染色工作液的配制

（1）先将低温保存的Calcein-AM溶液(2mM)和PI溶液(1.5mM)回到室温20-30min。 注意：第一次使用可对母液进行分装，以减少反复冻融次数。

（2）取5μL Calcein-AM溶液(2mM)和15μL PI 溶液(1.5mM)加入5mL 1×Assay Buffer，充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2μM，PI的工作液浓度为4.5μM。

注意：由于不同种类器官的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

a. 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育类器官1h，或者用70%乙醇孵育类器官1h，从而制备死类器官；

b. 用0.1-10μM的PI溶液进行死类器官染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度；

c. 用0.1-10μM的Calcein-AM进行死类器官染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察活细胞是否能被染色。

二、染色步骤：

 以24孔板，每孔25uL类器官基质胶凝聚物为例，检测时只需弃除类器官培养液，保留孔板内25μL类器官基质胶凝聚物，加入染色工作液即可。

1、将类器官培养基吸弃，加入PBS清洗2-3遍，以充分去除残留的酯酶活性，然后弃除PBS；

2、每孔加入500μL染色工作液，混匀，37℃孵育1h；

3、荧光显微镜下使用490±10nm激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。另外，使用545nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。

注意事项

1、由于Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。

2、由于Calcein-AM的稳定性比较差，此染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

3、碘化丙啶(PI)有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清洗。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

染色效果图展示

一、人肝细胞癌类器官明场图

人肝细胞癌类器官扩增过程（由少到多）

二、人肝细胞癌类器官活死染色图

人肝细胞癌类器官活细胞、死细胞、活死细胞染色合并图

人肝细胞癌类器官活死细胞染色合并图

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

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