脾脏单细胞悬液制备指南（酶解法）

2025-01-07

小鼠脾脏是一个重要的免疫器官，位于小鼠左侧腹腔中，靠近胃的左侧，呈长椭圆形状。大小会根据小鼠的品种和健康状况有所不同，一般来说，成年小鼠的脾脏长度大约在1.5厘米到2.5厘米之间。脾脏的颜色和质地可能会因为小鼠的品种和健康状况而有所变化，通常呈现出类似叶片的形态，颜色暗红。在实验研究中，小鼠脾脏细胞的分离、培养和计数是免疫学研究的重要方法，也是流式细胞术分析的前提。

一、耗材与试剂

表1 小鼠脾脏解离部分试剂耗材参考表

材料	试剂	设备
15/50mL离心管	1xPBS缓冲液	水平恒温摇床
10cm培养皿	RPMI 1640培养基	血细胞计数板
眼科手术剪、眼用镊	75%酒精	电动移液器、1mL枪头
100μm细胞筛网	FBS	高速离心机
10mL移液管	HBSS平衡液溶液	涡旋仪
5mL流式管	Absin组织解离试剂盒	4℃冰箱
	细胞染色缓冲液	流式细胞仪

表2 产品信息

货号	产品名称	规格	用途
abs50097	小鼠脾脏组织解离试剂盒	10T/25T	解离组织
abs7303	5mL流式管(无菌无酶,带盖)	500个/箱	流式管
abs9484	RPMI1640培养基	500mL	保存细胞活性
abs7232	70um细胞筛网	100个/箱	耗材
abs7102	15mL离心管(尖底)	100支/袋	耗材
abs7100	50mL离心管(尖底)	40支/袋	耗材
abs962	PBS缓冲液(1x)	500mL	试剂
abs9475	细胞染色缓冲液	500mL	试剂
abs9101	红细胞裂解液(1x)	100mL/500mL	裂红液

二、实验步骤

实验前准备：将脾脏小鼠脾脏组织解离试剂盒至于37度水浴锅中预热（脾脏组织解离试剂收到后，推荐分装冻存），如果使用红细胞裂解液为10×，需提前用超纯水稀释成1×。PBS提前预冷。

1、将小鼠颈部脱臼处死，75%酒精消毒小鼠表面，至于托盘中，左侧腹部朝上，镊子辅助操作，提起左腹侧中部皮肤，剪开皮肤，肉眼可见暗红色，长条状脾脏，剪开腹膜，镊子提起脾脏，见到分离，尽可能的除去结缔组织和脂肪，PBS冲洗，取新鲜小鼠脾脏组织100mg-200mg左右（一个20g的小鼠，脾脏重量可能在100mg左右，具体以实际情况为准）加至50mL无菌离心管中，用眼科剪将组织彻底剪碎至1-2mm³，加入小鼠脾脏组织解离试剂1mL；

2、将离心管置于恒温摇床上，37℃/180rpm震荡孵育30min左右，消化小鼠脾脏组织，可根据组织状态适当调整消化时间（脾脏相对比较好消化），混悬液中肉眼无明显组织块时，取少量悬液倒置显微镜下观察，可辅助判断，有大量活细胞即可停止消化（中心明亮），也可用台盼蓝染色或者其他方式；

红色圈内：死细胞绿色圈内：活细胞

3、孵育结束后将离心管内的组织匀浆用70um无菌过滤器过滤，然后加入细胞培养基冲洗无菌过滤器，用50mL的离心管收集滤液；

4、将收集的滤液1200rpm离心5min ，弃上清；

5、可使用红细胞裂解液去除组织解离过程中的红细胞，具体操作为，向第4步所得的沉淀加入3mL 1×红细胞裂解液，重悬沉淀，涡旋混匀，室温下避光孵育3-5min，加入2mL预冷的PBS, 1200rpm离心 5min，弃上清。重复洗涤一次；

6、弃上清，细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至5-10×10⁶个细胞/mL，将100uL/管的细胞悬液分配到12×75mm的流式管中，进行后续实验。

三、问题及策略

1、细胞得率低

一般情况下，成年C57BL/6小鼠一个脾脏可解离出大约10×10⁸–1.4×10⁸个细胞，如果发现细胞得率特别低，需要注意，样本获取阶段要尽可能完全去除组织周围的脂肪，尽可能将组织剪碎，从而提高细胞产量。在涉及的清洗步骤中，倒出上清液前，先用移液枪吸弃上层脂肪（可将枪头尖端修剪一下，避免吸气时堵塞）

2、细胞活率低，死细胞/碎片多

首先，解离试剂孵育的时间不能过长，长时间孵育会造成细胞活力降低及表面标记物丢失，死细胞过多，释放DNA丝缠绕，导致溶液粘稠，其次，千万不要缩短清洗的步骤，清洗可以帮助去除粘连体、碎片和死细胞，红细胞裂解液的孵育时间也不能过长，一般5min即可，如果细胞活力还是很低，建议检查红细胞裂解液是否新鲜有效。

3、红细胞裂解不完全

表现为洗涤步骤后出现明显的红色沉淀。确保制备新鲜的红细胞裂解缓冲液，在室温下进行裂解。裂解开始前，要确保细胞已完全重悬，裂解时间不能过短。

四、解离效果

该试剂盒讲小鼠Spleen组织处理为单细胞悬液后做流式：细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

注：本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究

五、其他产品推荐

货号	产品名称	规格
abs9907	流式绝对计数管	50T
abs9477	小鼠Fc受体阻断剂	200T/500T
abs9476	人Fc受体阻断剂	50T/200T
abs9488	鞘液	20L
abs9107	佛波酯	1mg/5mg/25mg
abs9108	离子霉素钙盐	1mg/5mg
abs970	D-PBS缓冲液(1×,无钙镁)	500mL
abs810012	Brefeldin A	10mg/25mg/50mg
abs812975	Monensin sodium salt	25mg/100mg
abs9475	细胞染色缓冲液	500mL
abs9110	固定剂	50mL
abs9111	破膜剂	150mL
abs7303	5mL流式管(无菌无酶,带盖)	1箱
abs1840002	APC Mouse anti-Human CD3 Antibody(3JI3-9)	25T/100T
abs182427	PE Mouse anti-Human CD4 Antibody(5D4)	25T/100T
abs182430	FITC Mouse anti-Human CD8 Antibody(3C4)	25T/100T
abs180046	PE-Cy7 Mouse anti-Human CD25 Antibody(BC96)	25T/100T
abs1840696	FITC Mouse anti-Human CD80 Antibody(2D10.4)	25T/100T
abs182338	APC Rat anti-Mouse CD25 Antibody(4APC61.5)	25T/100T
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