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公司动态

RCR、RT-PCR、qPCR、RT-qRCR傻傻分不清?

2025-01-22

聚合酶链反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)由Kary Mullis博士于20世纪80年代开发。该技术因其识别特定DNA序列并快速准确地合成大量副本的能力而被比作“分子复印机”。目前开发了各种基于原始PCR方法的衍生技术。实时PCR,也称为定量PCR(qPCR),将PCR放大和检测结合在一步中。另一种称为逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的技术使用RNA作为核酸起始模板。

 

PCR:包含DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs的反应混合物的重复加热和冷却循环。[1]每个循环都会使DNA的数量增加一倍左右,因为在下一个循环中,一条新的DNA链会成为复制的模板。这导致DNA数量呈指数增长。

 

图1 PCR的第一个循环[1]

 

● RT-PCR(Reverse transcription PCR):反转录PCR可以使用RNA作为模板,生成互补DNA(cDNA)。使用逆转录酶可生成cDNA的单链拷贝。这可以使用与RNA的PolyA尾部相结合的寡聚体(dT)引物,或使用随机六聚体(六至九个碱基长的引物,在RNA转录物的多个点上进行结合)来完成。一般来说,两种引物的混合被认为是最好的,因为它能够放大PolyA尾RNA(主要是mRNA)和不含PolyA的RNA(tRNA、rRNA等)。然后再用DNA聚合酶进行扩增,生成双链cDNA,送入基于PCR的标准扩增过程。

 

● qPCR(Quantitative PCR):是指定量实时PCR,即实时对DNA进行PCR扩增,通过荧光探针(最常见的是插层染料或水解探针)进行测量,从而对PCR产物进行定量。用于检测病原体的存在,并确定相关DNA序列的拷贝数。SYBR Green I是最常用的DNA结合荧光染料,当与双链DNA结合时会发出荧光,荧光强度与PCR产物的浓度成正比增长。

 

与标准PCR相比,定量PCR的优势在于无需琼脂糖凝胶就能实时观察到哪些反应起了作用。它还能进行真正的定量分析。

 

● RT-qPCR(Reverse Transcription Quantitative real-time PCR):这是一种将RT-PCR与qPCR相结合的技术,用于反转录定量实时PCR。通过在qPCR反应中使用cDNA来测量RNA水平,从而快速检测基因表达的变化。

 

RT-qPCR可用于研究用抑制剂、刺激剂、小干扰RNA(siRNA)或基因敲除模型等处理模型系统时基因表达的变化。这项技术还经常用于检测RNA-Seq实验之前(作为质量控制)和之后(确认变化)的表达变化。

 

RT-qPCR样品制备的最后一步是产生cDNA。除了考虑引物外,cDNA的生成可以是qPCR实验(称为一步RT-qPCR)的一部分,也可以与qPCR(两步RT-qPCR)分开生成(图3)。

 

方法

一步法RT-qPCR

两步法RT-qPCR

优点

实验变异较少,污染风险较小,并且能够进行高通量筛查

使每个样本有更多反应和灵活的引发选项

缺点

样本使用次数有限

需要更多的优化

应用

临床筛查

大规模基因表达分析

 

图2 RT-PCR, qPCR and RT-qPCR示意图 [2]

 

图3 一步法RT-qPC和两步法RT-qPCR[2]

 

● ddPCR(Droplet-based Digital PCR):样本穿过微流控芯片形成一种分段流,其中样本被分成数万个液滴可以充当PCR反应室,这些液滴被不混溶的液体(例如矿物油)分离,形成乳液[3]。将乳液收集在小瓶中,进行PCR,随后通过流式细胞仪处理样本,以计数PCR阳性的液滴数量。或将乳液送入塑料芯片中,形成单层液滴,进行热循环并捕获并评估液滴的荧光图像[4]。与qPCR相比,ddPCR具有精确度更高、绝对定量变异系数更低的优点[5]。PCR多重化通常通过基于探针的荧光进行,每个DNA/RNA具有不同的激发颜色。也用于生成单细胞RNA测序的库。

 

图4 ddPCR示意图[6]

 

参考文献:

[1] Jalali M, Zaborowska J, Jalali M. The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR[M]//Basic science methods for clinical researchers. Academic Press, 2017: 1-18.

[2] Zhang H, Tang K, Wang B, Duan CG, Lang Z, Zhu JK. Protocol: a beginner's guide to the analysis of RNA-directed DNA methylation in plants. Plant Methods. 2014 Jun 14;10:18. doi: 10.1186/1746-4811-10-18. PMID: 24955108; PMCID: PMC4065543.

[3] Schiffman M, Bauer H, Lorincz A et al. Comparison of Southern blot hybridization and polymerase chain reaction methods for the detection of human papillomavirus DNA. J. Clin. Microbiol.29(3), 573–577 (1991).

[4] Madic J, Zocevic A, Senlis V et al. Three-color crystal digital PCR. Biomol. Detect. Quant. 10, 34–46 (2016).

[5] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10, 1003 (2013).

[6] Hwang B, Lee JH, Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 2018 Aug 7;50(8):1-14. doi: 10.1038/s12276-018-0071-8. Erratum in: Exp Mol Med. 2021 May;53(5):1005. doi: 10.1038/s12276-021-00615-w. PMID: 30089861; PMCID: PMC6082860.

 

货号

名称

规格

abs60036

2×Taq PCR Mix

1mL×5

abs60037

2×Taq PCR Master Mix(for PAGE)

1mL×5

abs60034

2× Xerox PCR Master Mix

1mL×5

abs60057

2×HotStart Taq plus Master Mix(Quick Load)

1mL×5

abs60056

2×Pfu Master Mix

1mL×5

abs60035

2×Long Taq PCR Master Mix

1mL×5

abs60070

Whole Genome Amplification Kit

50T

abs60246

逆转录一管化三代预混液

100T

abs601510

First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover

100T

abs60074

One-Step RT-PCR Kit

200T

abs60267

miRNA探针法逆转录试剂盒

40T

abs60245

去基因组与逆转录一管化三代预混液

100T

abs60265

miRNA加尾法逆转录试剂盒

40T

abs60266

血浆miRNA加尾法逆转录试剂盒

50T

abs60269

miRNA茎环法逆转录试剂盒

50T

abs60150

RNA酶抑制剂

1mL

abs60075

Two-Step RT-PCR Kit

1kit

abs601511

2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系

1.7mL×3

abs60345

SYBR One-Step qRT-PCR Kit

100T

abs60247

抗体染料法定量PCR预混液(通用ROX)

1mL×5

abs601512

2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系(高浓度ROX)

1.7mL×3

abs60086

SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix

1mL×5

abs60270

miRNA茎环染料法荧光定量PCR试剂盒

200T

abs601513

2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系(低浓度ROX)

1.7mL×3

abs60272

miRNA探针法荧光定量PCR试剂

200T

abs60271

miRNA加尾染料法荧光定量PCR试剂盒

200T


 

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