细胞ATP发光检测攻略

检测原理

2D Luminescent Cell Viability Assay借助ATP依赖的荧光素酶催化的荧光素发光反应，通过化学发光信号测定细胞内ATP含量，从而检测细胞活力或定量检测活细胞数目，检测线性范围宽、灵敏度高、稳定性好。96孔板中，在100个至100,000个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同。此外，操作简单，试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约10min，无需洗涤细胞，也无需更换或去除培养液。相比于其他常见的细胞活力测定方法，如Calcein-AT、CCK-8等，2D Luminescent Cell Viability Assay更加简单快捷。

产品优势

2D Luminescent Cell Viability Assay(abs50065)检测灵敏度高、线性范围宽，可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。

1、方便快速：试剂盒中提供的检测试剂为即用型，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约 10 分钟；

2、灵敏度高：能够检测最低10nmol的ATP；

3、线性范围宽：96孔板中，在100个至100,000个细胞范围内有良好的线性关系，但不同细胞的检测数量上限会有不同；

4、高通量：可兼容少量样品检测以及大量样品的高通量筛选。

使用方法

一、试剂准备

试剂融化：实验前一天将试剂取出，置于4℃过夜融化。也可在实验当天将试剂取出，置于室温融化，或放置于22℃水浴融化，但需要注意水温不可超过25℃。

平衡至室温：若试剂在非室温条件下融化，使用前可将其置于22℃水浴，确保试剂平衡至室温后再用于检测。

注：一般针对5mL包装需要约10min；50mL包装需要约20min。

混匀：使用前轻柔颠倒5次使溶液混合均匀。

添加Triton X-100(abs9149)：吸取当次实验所需体积的试剂，加入适量体积Triton X-100，使其终浓度为0.2%。该液体为检测工作液（例如：8mLATP检测试剂加0.2mL Triton X-100）。

二、检测步骤

1、细胞培养

使用适合进行化学发光检测的96孔板(abs7149)，每孔接种100μL细胞（根据培养时间确定初始接种的细胞密度，检测时每孔细胞数量不宜超过10万个），同时设置不含细胞的培养液的孔作为阴性对照。也可以设置细胞的浓度梯度，以得到最佳的实验结果。37℃，5% CO₂培养细胞，根据需要在合适的时间加药处理细胞。

2、（可选）ATP 标准曲线的制作

把制备的 ATP 标准溶液用PBS稀释成适当的浓度梯度，96孔板每孔加入100μL的标准品。

3、细胞活力检测

（1）融解冻存的发光法检测试剂，并平衡至室温（或22℃恒温水浴平衡），并取出当次实验用体积的检测试剂，添加适量Triton X-100（使其终浓度为0.2%）；

（2）取出细胞培养板，室温平衡10min（或22℃恒温平衡，时间不宜过长，尽量控制在30min以内）；

（3）96孔板每孔加入100μL检测试剂（由于孔的边缘效应，可能会导致发光信号不稳定，不建议在边缘铺板）；

（4）室温振荡2min，以促进细胞的裂解；

（5）室温放置10min，使发光信号趋于稳定；

（6）使用多功能酶标仪进行化学发光检测。根据仪器要求设置相应的参数，每孔的检测时间一般为0.25-1s，具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整；

（7）根据化学发光读数计算细胞的相对活力，或根据ATP标准曲线计算ATP含量从而得出细胞的相对活力。

注：检测效果因细胞的种类不同而异，对于一些ATP含量特别高的细胞，在细胞数量达到 100,000以上可能会出现化学发光读数继续升高，但丧失线性关系。

三、注意事项

1、温度：试剂中含有荧光素酶，反复冻融会影响其活性。建议分装后置于-20℃避光保存。试剂及细胞样品使用前均需平衡至室温，以避免酶催化效果的影响；

2、化学因素：荧光素酶的反应速率和发光强度受化学环境影响。不同类型的培养基和血清中发光强度和衰减速率存在差异。另外，药物含量较高时可能会干扰荧光素酶反应，从而影响发光信号。建议设置含有药物的细胞培养液对照孔以排除溶剂的干扰。如培养基对发光强度影响较大，可在检测前去除，并用PBS润洗一次，此时，Triton X-100添加量减半，至终浓度0.1%即可；

3、光敏感：本试剂对光敏感，如果储存时暴露在光照下，会加快发光强度的衰减。如果试剂从原来的容器转移，请确保避光保存；

4、ATP 污染：建议操作时佩戴口罩和乳胶手套，避免接触可能受到污染的表面和设备。操作时避免多次将枪头尖端插入试剂瓶中。

今天讲解就到这了，大家如有细胞实验问题，欢迎一起交流哦！

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