人神经干细胞培养方法及诱导形成脑类器官

三、人神经干细胞培养方法

 

准备神经干细胞(NSC)扩增完全培养基

 

1、NSC完全培养基需要补充NSC补充剂、L-丙氨酰-谷氨酰胺。

2、在无菌环境中，依次将20mL NSC补充剂和5mL 200mML-丙氨酰-谷氨酰胺(abs9295)（2mM终浓度）加入到含有480mL NSC培养基中，此时即得神经干细胞(NSC)扩增完全培养基(abs9821)。

3、（可选）在培养基中加入10mL/L的抗生素（青霉素-链霉素）溶液。

注意：在所有成分的有效期限内，在2°C至8°C的黑暗环境中储存，可稳定长达4周。

注意：可选择添加200μM抗坏血酸，特别是悬浮培养。

 

包被孔板

 

1、基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1mL/0.5mL即用型基质胶(abs9410)，轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1h-2h，实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃储存，并于1周内使用。

2、在使用前，将已经平衡好的即用型基质胶弃掉，然后加入预热的完全NSC培养基。

 

NSC传代

 

1、当细胞密度达到90-100%的融合度时，丢弃培养瓶中的培养基。

2、用5mL不含钙和镁的预温DPBS洗涤细胞，然后吸弃溶液。

3、在每个培养瓶中加入1.0mL预热的人多能干细胞消化液(abs9409)，然后在室温下孵育2-5min。在孵育前确保完全覆盖细胞。

4、用倒置显微镜观察细胞是否脱离。如有必要，轻拍培养瓶以促进细胞脱离。

5、轻轻上下移液，使团块分散到单个细胞悬液中。

6、加入9mL预热好的NSC 完全培养基停止细胞解离反应，然后将细胞悬液转移到无菌离心管中。

7、200×g离心4min。

8、丢弃上清，然后用适量NSC完全培养基重悬细胞沉淀。

9、用自动细胞计数器测定总活细胞密度。

10、从每个覆盖层培养瓶中除去覆盖层溶液，然后加入5mL预热的NSC完全培养基，添加Y27632（终浓度10μM）。

11、在每个培养瓶中加入5×10⁴细胞/cm²(例如，1.25×10⁶细胞/T-25培养瓶)，然后混合或旋转细胞悬液以确保均匀分布。

12、于37°C，5%CO₂的潮湿环境中孵育。

注：为了获得最佳性能和细胞生长，每2-3天更换一次培养基，用新鲜的预热的NSC完全培养基。

 

NSC冻存

 

1、准备干细胞冻存液(abs9412)。

2、按照“NSC传代”中的步骤1至步骤7收集细胞进行冷冻保存。

3、在离心过程中，计算细胞密度为2×10⁶个活细胞/mL所需的最终体积。

注：接下来的步骤需要半体积的室温NSC培养基和半体积的冻存液。

4、丢弃上清，然后用NSC 完全培养基重悬细胞。

5、加入等量的冻存液，使终浓度为10%DMSO。

6、立即将细胞悬液等分放入冻存瓶中（1mL/瓶）。

7、按照标准程序（每分钟降低1°C）在自动或手动控制速率的冷冻设备中实现低温保存。

8、将冷冻细胞转移到液氮中。

 

NSC复苏

 

1、在37°C水浴中迅速(<2min)解冻细胞。

2、用移液管将冻存液全部移入无菌的15mL离心管中。

3、小心滴加（每秒1滴），加入4mL预热好NSC完全培养基，然后轻轻旋转离心管混合。

4、继续添加预热的NSC完全培养基至10mL。

5、200×g离心4min，确认细胞沉淀，丢弃上清。

6、加入5mL预热好NSC完全培养基重悬细胞沉淀，然后添加Y27632（终浓度10μM），再将离心管的全部内容物转移到包被的组织培养瓶中。

7、于37°C，5%CO₂的潮湿环境中孵育。

8、复苏后24h用新鲜的预热过的NSC 完全培养基替换培养基。

注：为了恢复在NSC中生长的细胞，我们建议在初始传代时以≥1×10⁵个细胞/cm²的密度接种细胞。

 

四、人神经干细胞诱导形成脑类器官

 

原代

 

一、准备工作

 

1、仪器设备

CO₂培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）。

 

2、剂耗材（以肠癌为例）

动物脑类器官培养基试剂盒(abs90050)、基质胶（低因子、无酚红）(abs9495)、15mL离心管(abs7102)、1.5mL EP管若干(abs7119)、24孔细胞培养板(abs7035)、金属冰盒。

 

 

组分名称	规格
动物脑类器官培养基A	100mL
类器官原代培养缓冲液B	250mL
原代组织消化液C	30mL
类器官传代消化液D	30mL
组织保存液E	100mL
类器官冻存液F	20mL
类器官传代培养缓冲液G	250mL

 

二、操作流程

 

1、加胶-点板-加液（这里是整个原代操作的点睛之笔）

 

（1）准备工作

 

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

 

低温金属冰盒(abs7289)

 

（2）接种要求

 

24孔板(abs7035)，每孔25uL基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液

 

（3）接种密度

 

干细胞团沉淀

 

消化收集神经干细胞团到15mL离心管，于300g 4℃富集离心5min后移去上清。

密度建议1：基质胶体积：细胞团沉淀体积=25:1（如果估摸细胞团沉淀体积困难，通常加300uL基质胶足够）

密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

 

（4）加胶-点板

 

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

（5）加液

 

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μL类器官培养基A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-500um，可进行传代操作。

 

 

铺板密度

 

胎羊及胎鼠类器官生长图

 

传代（消化分两种情况）

 

一、类器官数量较多或体积较大传代步骤

 

1、类器官收集及洗涤

 

1）收集：移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）。

 

 

2）洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

 

3）接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

 

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

 

2、类器官消化

 

1）添加2-3mL类器官传代消化液D于超净台内消化2-3min，消化期间吹打1-2次。此步骤以消化成细胞团为主，千万不要消化成单细胞，单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜，可吸取数微升镜下观察，如果有较多细胞团可停止消化。

 

2）添加5倍类器官传代培养缓冲液G（缓冲液：消化液=5:1）终止消化，300g 4℃离心5min弃去上清（如果有基质胶残留，残留量<50uL正常，不影响传代类器官增殖）

 

 

3、加胶-点板-加液

 

（1）准备工作

 

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

 

（2）接种要求

 

24孔板(abs7035)，每孔25uL基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液

 

（3）接种密度

 

密度建议1： 类器官通常按1:2传代，例如，24孔板收集5孔，传代10孔，需要的基质胶量25*10=250uL

密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

注意：不管是按密度建议1还是，密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍

 

（4）加胶-点板

 

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

（5）加液

 

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μL人肠癌类器官培养基 A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200-300um，可进行传代操作。

 

 

二、类器官数量不足或体积较小时：

 

1、类器官收集、吹打、洗涤

 

1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶。

 

2）进行吹打，将类器官吹成细胞团（可取样镜下观察有较多细胞团时可停止吹打）；

 

3）洗涤： 24孔板，每5孔为一组，收集在15mL离心管中，加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置 40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

 

4）接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

 

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留细胞团沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶细胞团混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶细胞团混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

 

2、加胶-点板-加液

 

（1）准备工作

 

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

 

（2）接种要求

 

24孔板(abs7035)，每孔25uL基质胶细胞团混合物，500-750uL类器官培养液

 

（3）接种密度

 

密度建议1： 对于类器官数量较少的情况，为了维持生长所需的旁分泌信号，需要2-3孔富集到1孔，例如，24孔板收集6孔，2孔富集1孔，铺3孔，需要的基质胶量25*3=75uL

密度建议2：500个细胞团/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

注意：不管是按密度建议1还是按密度建议2，如果有残留的基质胶，新胶量至少是残留胶量的1.5倍

 

（4）加胶-点板

 

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

（5）加液

 

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μL类器官培养基 A进行培养。大概7-10天，多数类器官直径在200-300um，可进行再次传代。

 

冻存

 

冻存要领:

类器官不需要消化（消化后的类器官复苏活率低）；

在类器官指数增长期冻存（等到该传代的时候类器官活性比指数期差），也就传代后的Day3-Day4，多数类器官直径在100um-200um，这个时机选择冻存。

 

一、类器官收集及洗涤

 

1、收集：移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G，轻柔吹散基质胶，收集在15mL离心管中（24孔板，每5孔为一组）。

 

 

2、洗涤：加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL（缓冲液越多，基质胶被稀释的越充分，越容易去除），4℃静置 40min或-20℃放置5min（目的是使基质胶软化，如果冰箱保温效果强，缩短冷冻时间，摸索合适的冷冻时间时，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

 

3、接下来将离心管进行300g，4℃，离心5min，离心完通常会有这两种情况：

 

第一种是正常情况，分成三层（如下图），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况，分成两层（如下图），这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液，留下基质胶类器官混悬液，重复上一步洗涤步骤，再次冷化离心，通常能出现清晰分层（缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层），此时弃掉上清和基质胶层，保留类器官沉淀即可。如果依然是两层（缓冲液层和基质胶类器官混悬液层），此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液，保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件：

a 离心机的选择非常重要，水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离；

b 离心机的温度最好是4℃（可避免基质胶固化），离心转速可适当提高（最高不要超过500g），离心时间可适当加长（最常不超过10min）。

 

二、类器官冻存

 

1、冻存密度，以24孔板为例

 

密度建议1：2孔/mL冻存液

密度建议2：500个类器官/mL冻存液（如果想计数冻存，可以参照此密度建议）

 

2、添加适量类器官冻存液F，轻柔吹打重悬，建议立即进行冻存。（放置太久，DMSO对类器官有损伤）

 

3、梯度冻存：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

     手动冻存：4℃冰箱放置30min，转移至-20℃放置1h，然后移至-80℃过夜，第二天取出放入液氮罐。

 

复苏

 

一、实验前准备

 

1、将水浴锅预热至37℃；

2、细胞实验室进行常规消毒，用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面；

3、在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

 

二、取出冻存管

 

1、根据类器官冻存记录按标签找到所需类器官的编号。

2、从液氮罐中取出冻存盒，取出所需的冻存管，同时核对冻存管外的编号。

 

三、迅速解冻

 

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动，使管中地液体迅速融化。

2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁，再拿入超净台内。

 

四、将类器官冻存液移入15mL离心管，添加10倍体积类器官传代培养缓冲液G（缓冲液体积：冻存液体积=10:1）重悬，轻柔吹打混匀，300g 4℃离心5min，弃上清。

 

五、加胶-点板-加液

 

1、准备工作

 

（1）基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；

（2）枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；

（3）融化后的基质胶可一直放4℃储存，建议2周内用完。

 

2、复苏要求

 

24孔板(abs7035)，每孔25uL基质胶类器官混合物，500-750uL类器官培养液

 

3、复苏密度

 

复苏密度建议1：1:1接种（原来冻几孔就复苏几孔）

复苏密度建议2：250个类器官/25uL基质胶（如果想计数接种，可以参照此密度建议）

 

4、加胶-点板

 

向类器官沉淀加入基质胶(abs9495)，进行吹打混匀（不要满吹满打，容易产生气泡），然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后，加胶，混匀，点板控制在半分钟内，有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

5、加液

 

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶，添加500-750μL类器官培养基A进行培养。大概10-14天，多数类器官直径在200um-500um，可进行传代操作。

 

6、脑类器官鉴定图

 

 

今天讲解就到这了，大家如有实验问题，欢迎入群交流哦！

 

 

本期小爱推荐

货号	品名	规格
abs9403	人多能干细胞培养基	500mL
abs9822	人多功能干细胞(PSC)诱导神经干培养基	1kit
abs9821	神经干细胞(NSC)扩增培养基	1kit
abs9409	人多能干细胞消化液	100mL
abs9295	L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液(100×,200mM)	100mL
abs9412	ES/iPS细胞冻存液	100mL
abs9410	即用型基质胶	100mL
abs90050	Organotial动物脑类器官培养基试剂盒·	1kit
abs9495	基质胶(低因子,无酚红)	1.5mL*8
abs7289	2mL低温金属冰盒(24孔,平底)	1个
abs7033	细胞培养板(标准透明6孔板)	50个/箱
abs7035	细胞培养板(标准透明24孔板)	1箱
abs7164	细胞冻存管	1箱
abs7053	10mL一次性移液管	1箱
abs7054	25mL一次性移液管	1箱

 

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