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蛋白提取（核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白）解决方案
2025-03-25
一、实验原理
蛋白提取试剂盒通过温和裂解细胞或组织释放总蛋白，并利用特异性结合、离心分离及缓冲液洗脱等技术去除杂质（如核酸、脂类等），最终获得高纯度、高活性的目标蛋白。
核心步骤：
1、裂解：裂解液（含去污剂、蛋白酶抑制剂等）破坏细胞膜结构，释放胞内蛋白；
2、离心去除碎片：高速离心去除未裂解的细胞碎片、细胞核及大分子杂质；
3、蛋白纯化：通过离心柱或特异性结合树脂选择性吸附蛋白，杂质随废液排出；
4、洗脱：低盐缓冲液或去离子水洗脱目标蛋白，避免变性。
二、材料准备
试剂盒：蛋白提取试剂盒 （适用于各种动物、植物细胞和组织细菌样本）
自备材料：
- 新鲜样本（细胞、组织等）
- 预冷 PBS 缓冲液 （货号：abs962）
- 离心机（可达到12,000xg）
- 冰盒或低温操作台
- 涡旋振荡器 （货号：abs72001）
- BCA 蛋白定量试剂盒 （货号：abs9232）
- 液氮（组织样本需速冻）
三、实验步骤 （裂解蛋白所有步骤都需在冰上或4℃进行）
1、样本处理
- 细胞样本：离心收集细胞（1500xg, 3min），PBS 洗涤 2 次，吸尽残留液体。
- 组织样本：切取 10–50 mg，液氮速冻后研磨成粉末。
2、裂解 （具体步骤参考不同提取试剂盒说明书）
- 加入 200-500μL 预冷裂解液（含蛋白酶抑制剂），涡旋混匀。
- 冰上裂解 20-30 分钟，每隔 5 分钟涡旋 10 秒。
3、离心去碎片
- 12,000xg、4℃ 离心 10 分钟，取上清（即为总蛋白）转移至新离心管。
-核蛋白需先分离细胞核：低渗裂解后离心收集核沉淀，再溶解。
4、蛋白纯化
（注：下游做质谱或酶活性分析需要4、5步）
- 将离心柱用平衡缓冲液预处理 5 分钟，离心弃废液。
- 将裂解液上清加入离心柱，12,000 xg 离心 1 分钟，弃废液。
- 加入洗涤缓冲液 500 μL，离心 1 分钟，重复 2 次。
5、洗脱蛋白
- 加入 50–100 μL 洗脱缓冲液，静置 2 分钟后离心 1 分钟，收集洗脱液（即目标蛋白）。
6、蛋白保存
- 将提取的蛋白样品分装到小离心管中，可根据实验需求短期保存在 - 20°C 或长期保存在 - 80°C 冰箱中，避免反复冻融。
四、结果分析
1、浓度测定：
- 使用 BCA 法测定蛋白浓度，OD562 计算浓度（标准曲线法）。
2、纯度评估：
- 分光光度计检测 A???/A??? 比值（理想值 1.8–2.0，若 >2.0 提示核酸残留）。
3、电泳验证：
- SDS-PAGE 电泳检测条带清晰度，无拖尾或杂带表明纯度较高。
五、常见问题及解决方案
|
问题 |
可能原因 |
解决方案 |
|
蛋白得率低 |
裂解不充分或蛋白酶降解 |
延长裂解时间，增加裂解液体积；确保添加蛋白酶抑制剂 |
|
洗脱液杂质多 |
洗涤步骤不彻底 |
增加洗涤次数或延长离心时间 |
|
蛋白浓度过高/过低 |
样本量不匹配或洗脱体积不当 |
调整样本量与裂解液比例，优化洗脱体积 |
|
A???/A??? 比值异常 |
核酸或盐离子残留 |
增加洗涤次数，或使用核酸酶预处理样本 |
|
电泳条带模糊 |
蛋白降解或SDS未充分结合 |
全程低温操作，电泳前煮沸样本 5 分钟 |
六、注意事项
1、全程低温操作（冰上或4℃环境），防止蛋白降解；
2、裂解液需现用现配，避免反复冻融；
3、组织样本需充分匀浆，避免未裂解细胞残留。
通过本方案，可高效提取高纯度蛋白，适用于 Western Blot、ELISA、质谱分析等下游实验。
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