IPS诱导内耳类器官培养攻略

2025-07-30

一、实验准备

hPSC诱导分化内耳类器官试剂盒（abs90132-1kit）

产品组成：

培养阶段	编号	名称	规格	保存
EB诱导阶段	IE01	EB形成培养基	30mL	-20℃，12个月
EB诱导阶段	IE01-A	补充剂A	40μL	-20℃， 6个月
EB分化阶段	IE02	基础培养基1	20mL	-20℃，12个月
	IE02-B	补充剂B	250uL	-20℃，6个月
	IE02-C	补充剂C	70uL	-20℃，6个月
	IE02-D	补充剂D	50uL	-20℃，6个月
耳泡形成阶段	IE03	基础培养基2	50mL	-20℃，12个月
耳泡形成阶段	IE03-E	补充剂E	1.2mL	-20℃，6个月
内耳类器官成熟阶段	IE04	成熟培养基	200mL	-20℃，12个月
类器官成熟阶段		Matrigel	500uL	-20℃，6个月

2、辅助试剂

	品名	货号	规格	储存条件及周期
1	PBS	abs962	500mL	2~8℃或室温下保存，有效期12 个月。
2	Advance 人多能干细胞培养基	abs9404	100mL	-20℃保存，有效期2年。
3	人多能干细胞消化液	abs9409	100mL	-20℃保存，有效期2年。

3、实验耗材

	品名	货号	规格	储存条件及周期
1	细胞培养板（标准透明6孔板）	abs7033	1箱	室温，保质期3年。
2	细胞培养板（标准透明12孔板）	abs7034	1箱	室温，保质期3年。
3	细胞培养板（标准透明24孔板）	abs7035	1箱	室温，保质期3年。
4	1.5 mL离心管	abs7119	1箱	室温，保质期3年。
5	15 mL离心管	abs7120	1箱	室温，保质期3年。
6	50 mL离心管	abs7121	1箱	室温，保质期3年。
8	10mL一次性移液管	abs7053	1箱	室温，保质期3年。
9	50mL一次性移液管	abs7055	1箱	室温，保质期3年。
10	10uL吸头（盒装，无菌无酶）	abs7072	1箱	室温，保质期3年。
11	200uL吸头（盒装，无菌无酶）	abs7075	1箱	室温，保质期3年。

二、诱导流程图

三、试剂盒使用流程

①EB 形成（2 天）
1、hPSC 于基质胶包被的六孔板的一个孔，用Advance 人多能干细胞培养基培养增殖至 70-80%汇合度。
2、吸去Advance 人多能干细胞培养基。
3、孔中加入 1mL PBS（无钙镁离子）洗，吸去。
4、孔中加入 1mL 人多能干细胞消化液，37℃消化 3min。
5、将 20mL EB 形成培养基和 40μL EB 形成补充剂混合均匀获得 EB 形成完全培养基。（注意：所用培养基均应提前在工作台放置 30min 以恢复室温，后面操作同理。）
6、消化完成后于显微镜下可看到克隆发白发亮。
7、吸去人多能干细胞消化液，每孔加入 1mL EB 形成完全培养基终止消化。
8、轻轻吹打孔内细胞 2-3 次，将 500uL 细胞悬液移至有 9mLEB 形成培养基的 15mL 离心管中。
9、100g 离心 5min，吸弃上清。
10、轻弹细胞沉淀液，加入一毫升 EB 形成完全培养基重悬细胞，将细胞悬液加入 9mLEB 形成完全培养基，重新制成细胞悬液。
11、将细胞悬液移至加样槽，使用多通道移液器种到超低吸附 96 板中，每孔 100μL，接种 96个孔，普通 96 孔板每孔加 100μL PBS，96 孔作为配平。
12、于低速水平离心机，850rpm/120g 离心 3min，将板放入 37℃，5%CO₂ 的培养箱，记为 D-2。
13、第 2 天(D-1）可以看到形成大小均一的 EB。每孔补充 100μL EB 形成培养基（不含补充剂），放入 37℃，5%CO₂ 的培养箱。
（注意：补充 EB 形成培养基后，可将多通道移液器枪头置于液面下轻轻吹打，在不影响到 EB的情况下混匀培养基。）

②EB 分化阶段（12 天）
14、D0，解冻补充剂 A，9.6mL 预冷的基础培养基 1 与补充剂 A、200μL Matrigel 混合均匀，恢复至室温后，按每孔 100μL 更换培养基，诱导 EB 分化，用多通道移液器轻轻吹打，使 EB悬浮。在 37℃，5%CO₂ 培养箱中培养 4 天。
15、D4，解冻补充剂 B，2.5mL 基础培养基 1+补充剂 B 混合均匀，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并轻轻移液 8-10 次混匀，使每孔培养基的终体积为 125μL，37℃，5%CO₂培养 4 天。
16、D8，解冻补充剂 C，2.5mL 基础培养基 1+补充剂 C 混合均匀，按每孔 25μL，加到 96 孔板中，并轻轻移液 8-10 次混匀，使每孔培养基的终体积为 150μL，将 96 孔板放回培养箱，37℃，5%CO₂ 培养 4 天。

③耳泡形成阶段（6 天）
17、D12，EB 诱导结束，准备好基础培养基 2（提前在冰上冷藏至少 30min）；或者，在 D11 上使基础培养基 2 存储在 4°C 过夜。Matrigel 提前与补充剂 D 于 4℃解冻，冷的基础培养基 2 与补充剂 D 混合均匀。将 200uL Matrigel 加入 20mL 冷的混合培养基中，反复吹打溶解 20 次，复温到室温。将 96 孔板中的聚集物转移到两个 100mm 培养皿中，每个培养皿中有 48 个聚集体。用 1-2mL 的 PBS 洗涤聚集体 2 次，再用 1mL 不含 Matrigel 的混合培养基洗涤 1 次，然后分别加入 10mL 含 Matrigel 的混合培养基，将培养皿放入培养箱中，37℃，5%CO₂ 培养 3天；D15 吸掉培养皿中的培养基，重新加入不含 Matrigel 的混合培养基，继续培养 3 天，诱导
耳泡形成；
（注意：10mm 皿一般换液需要 10mL 培养基）

④内耳类器官成熟阶段（42 天）
18、D18-60，内耳类器官逐渐成熟，将培养基换成成熟培养基，开始长期培养，每 5 天换一次液，到 60 天左右获得具有感觉毛细胞的成熟内耳类器官。

三、内耳类器官鉴定图

产品推荐

货号	品名	规格	储存条件及周期
abs90132	hPSC诱导分化内耳类器官试剂盒	kit	-20℃保存，基础培养基有效期12个月，补充剂有效期6个月。
abs962	PBS	500mL	2~8℃或室温下保存，有效期12 个月。
abs9404	Advance 人多能干细胞培养基	100mL	-20℃保存，有效期2年。
abs9409	人多能干细胞消化液	100mL	-20℃保存，有效期2年。
abs7033	细胞培养板（标准透明6孔板）	1箱	室温，保质期3年。
abs7034	细胞培养板（标准透明12孔板）	1箱	室温，保质期3年。
abs7035	细胞培养板（标准透明24孔板）	1箱	室温，保质期3年。
abs7119	1.5 mL离心管	1箱	室温，保质期3年。
abs7120	15 mL离心管	1箱	室温，保质期3年。
abs7121	50 mL离心管	1箱	室温，保质期3年。
abs7053	10mL一次性移液管	1箱	室温，保质期3年。
abs7055	50mL一次性移液管	1箱	室温，保质期3年。
abs7072	10uL吸头（盒装，无菌无酶）	1箱	室温，保质期3年。
abs7075	200uL吸头（盒装，无菌无酶）	1箱	室温，保质期3年。

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