特应性皮炎（AD）造模&检测完整解决方案

特应性皮炎（AD）是一种以表皮屏障受损、Th2偏倚炎症与瘙痒为核心特征的慢性复发性皮肤病。本文整合常用AD动物模型（MC903、HDM、OVA、OXA、DCNB及遗传/自发模型）与人源三维皮肤/类器官模型（RHE/FTSE、皮肤-on-chip、hiPSC皮肤类器官）的造模SOP、用剂、时间窗与读出指标要点等，以便快速落地于药效学筛选、机制验证与跨模态对照。

 

1、背景与研究意义

? AD的核心机制包括表皮屏障缺陷（如FLG/CLDN1下降）、角质细胞来源报警素（TSLP/IL33）、Th2优势炎症（IL4/IL13）以及微生物定植和超抗原加重，慢性期可见Th1/Th17参与 [1–3]。

? 针对不同科学问题（屏障—免疫互作、环境变应原触发、神经-瘙痒轴、微生物加重、遗传易感）选择合适模型与读出，对药效学与机制研究至关重要 [1–4]。

 

2、模型选型与应用场景

 

?快速药筛、TSLP/Th2轴：MC903外用7–14天，稳定诱导TSLP/Th2炎症 [1,2]；

?环境变应原与IgE：HDM经皮贴敷2–4周，可合并轻度屏障破坏；可加SEB模拟急性加重 [3,12–13]；

?抗原特异性应答：OVA致敏+表皮激发，建立特异性IgE/IgG1与皮肤炎症 [4]；

?慢性复发与免疫演替：OXA、DNCB反复挑战3–5周，苔藓样增厚明显 [5][14]；

?遗传易感与自发病程：Nc/Nga、flaky tail（Tmem79/Flg缺陷）等 [6–7]；

?人源机制与筛药：RHE/FTSE + IL4/IL13/HDM/SEB，或类器官/onchip [8–12]。

 

3、动物模型SOP

 

3.1 MC903（calcipotriol）（abs820222）急性AD样皮炎模型

 

原理：维生素D类似物激活角质细胞，强诱导TSLP，驱动Th2炎症与瘙痒 [1–2]。

动物：C57BL/6或BALB/c，6–12周龄，雌雄均可。

 

关键试剂与材料

?MC903（溶剂：乙醇或乙醇:丙二醇=7:3）；无菌棉签/微量加样器；

?检测：卡尺、TEWL仪、ELISA、流式/免疫组化。

 

步骤与剂量（耳廓为例）

?配制MC903工作液（避光）；使用前新鲜或短期4℃保存；

?每日在双耳背侧各点涂1–4 nmol/耳（10–20 μL/耳），连续7–14天 [1]；

?读出：耳厚、皮损评分、TEWL；H&E/甲苯胺蓝；FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO1、TSLP/IL4/IL13（IHC/IF、qPCR、ELISA）；血清总IgE；抓挠行为学 [1–2]。

 

注意事项：从低剂量起步，7–10天常见稳定表型；避免剂量过高致表皮溃破 [1]。

MC903特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [1]

 

3.2 屋尘螨（HDM）经皮贴敷模型

 

原理：变应原与蛋白酶活性破坏屏障并致敏，诱导Th2/Th17混合炎症与IgE [3]。

关键试剂：HDM提取物（Dp/Df），PBS；屏障破坏材料（胶带或0.5–1% SDS）；可选SEB加重 [3,12–13]。

 

步骤（背部贴敷）

1. 剃毛并胶带剥离10–15次或0.5–1% SDS短时外涂后洗净 [3]。

2. 纱布片载HDM 100–500 μg/次（约100 μL PBS），半透贴膜固定24–72 h；每周2–3次，连续2–4周 [3]。

3. 可选：顶端加入SEB 0.1–1 μg/mL短时暴露以模拟细菌超抗原加重 [12–13]。

4. 读出：皮损评分、TEWL、总/抗HDM特异性IgE；皮肤与引流淋巴结流式；炎症与趋化因子谱[3]。

注意事项：不同批次HDM的蛋白酶/内毒素差异大，建议先小试确定载量与周期 [3]。

 

3.3 卵清蛋白（OVA）（abs9203）致敏+表皮激发模型 [4]

原理：蛋白变应原经皮致敏与/或系统致敏后激发，诱导特异性IgE与皮肤炎症。

 

两种路径

?纯表皮致敏：背部胶带剥离后贴敷OVA 100–500 μg/次（100 μL PBS），持续1周；间歇1周后重复2–3轮。

?腹腔致敏+表皮激发：day 0与7腹腔注射OVA+明矾，day 14起表皮贴敷激发2–3周。

 

读出：皮损评分、总/OVA特异性IgE/IgG1；组织学与细胞因子谱。

 

注意事项：若特异性IgE不显著，优先采用“腹腔致敏+表皮激发”路径。

OVA致敏流程示意图 [4]

3.4 氧唑酮（OXA）（abs42065081）慢性皮炎模型 [5]

 

原理：反复化学致敏与挑战，形成慢性苔藓样病灶；免疫谱从Th2向Th1/Th17演替。

 

步骤：1. 致敏：5% OXA（丙酮:橄榄油=4:1）腹部单次外涂。

2. 挑战：1% OXA（丙酮:橄榄油=4:1）耳或背部，每2–3天一次，共3–5周。

 

读出：皮厚、H&E（abs9217）、5（神经纤维）（abs159682）、细胞因子谱（后期IFNγ/IL17A）（abs520007，abs560033，abs520009）。

 

注意事项：化学致敏剂需佩戴个人防护装备与通风，评分与采样尽量盲法与随机化。

氧唑酮诱导的 BALB/c 小鼠（10 次挑战）特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [5]

3.6 DNCB诱导AD样模型 [14]

 

原理：DNCB（2,4 - 二硝基氯苯）是一种半抗原，其诱导 AD 模型的核心机制是通过皮肤致敏 - 激发循环引发 Th2 型免疫应答。

 

步骤：1. 致敏： 1% DNCB 溶液（丙酮：橄榄油 = 3:1），背部涂抹，体积约 20-50 μL，连续 2-3 天。

2. 挑战：1% -0.5% DNCB（丙酮:橄榄油=3:1）耳或背部，每周2-3 次，持续 2-6 周。

 

读出：皮厚、H&E（abs9217）、5（神经纤维）（abs159682）、细胞因子谱（后期IFN-γ/IL-17A）（abs520007，abs560033，abs520009）。

DCNB诱导NC/Nga小鼠特应性皮炎（AD）样模型造模流程 [14]

 

3.7 遗传/自发模型概述

 

Nc/Nga：常规环境可自发AD样病变，适于长期慢性与微生物相互作用研究 [6]。

flaky tail（Tmem79/Matt突变，常伴Flg异常）或Flg-/-（abs6112402）：屏障缺陷导致自发/诱发性皮炎易感 [7]。

角质细胞TSLP过表达（K14-TSLP）等条件性模型用于验证表皮—免疫通路因果性 [2]。

说明：遗传模型表型受微生物与环境影响显著，需标准化饲养与屏障条件 [6–7]。

 

4、人源三维/类器官模型SOP

 

4.1 重建人表皮/全层皮肤（RHE/FTSE）

 

原理与组成：原代人角质细胞与成纤维细胞；胶原I凝胶+Transwell（abs50061，abs50062）；空气-液界面分化10–14天形成RHE（加成纤维细胞与凝胶为FTSE）[8]。

 

AD诱导策略

 

?细胞因子：IL-4（abs04698）+IL-13（abs04079）各10–50 ng/mL，处理3–7天；可合并IL-31（abs05989）、TSLP（abs05532）或IL-33（abs06263）[9–10]。

?变应原/毒素：顶端给HDM 10–100 μg/mL，或SEB 0.1–1 μg/mL [9–10,12–13]。

?屏障基因操作：siRNA/CRISPR敲低FLG/CLDN1（abs6112402），或使用AD患者来源角质细胞 [9–10]。

 

关键读出：TEER、FITCdextran/Lucifer Yellow通透；分化/紧密连接蛋白（FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO-1）；趋化与报警素（CCL17/TARC、TSLP等）；转录组/蛋白组 [8–10]。

 

注意事项：保持ALI与温湿度稳定，TEER检测前平衡，避免温度漂移 [8]。

 

4.2 皮肤-on-chip微流控模型 [11]

 

原理与建模：将RHE/FTSE置入灌流微腔，上腔施加IL-4（abs04698）+IL-13（abs04079）或HDM/SEB刺激，下腔接入免疫细胞，在线监测TEER/通透与迁移。

 

适用：透皮药代、免疫迁移与急慢性切换研究；有利于模拟血流剪切力。

 

要点：稳定流速与供氧，避免气泡；可串联图像与电学传感。

 

微流控系统及传输系统模型 [11]

 

4.3 hiPSC皮肤类器官 [12]

 

原理：hiPSC（abs90290）经阶段性诱导（TGFβ/FGF通路调控）获得含表皮真皮毛囊/神经成分的皮肤类器官。

 

AD建模：成熟后处理IL-4（abs04698）/IL-13（abs04079）、HDM、SEB或导入FLG突变，表型化屏障与神经-免疫指标。

 

要点：培养周期（周—月）与批间差较大，需严格质控与标准化。

皮肤类器官诱导流程 [12]

 

5、读出指标与检测面板

 

功能/临床：耳厚/皮厚、皮损评分、TEWL（动物）；TEER、通透性探针（体外）。

 

组织与成像：H&E（abs9217）、甲苯胺蓝（肥大细胞）（abs90037）、IF/IHC/mIHC（KRT14/10、FLG/LOR/IVL、CLDN1/ZO-1、TSLP、PGP9.5）（abs50038，abs957）；必要时共聚焦/光谱拆分扫片仪。

 

免疫学：血清总/特异IgE（abs551023，abs552210）；流式（Th2/ILC2/嗜酸粒/肥大细胞/树突状细胞）；细胞因子（IL-4/IL-6/IL -8/IL-13/IFNγ/IL-17A等）（abs510017、abs520003；abs510016，abs520012等，详见下方表格）。

 

分子与脂质：qPCR（abs60086）、RNA-Seq/单细胞、神经酰胺谱。

 

微生物：金黄色葡萄球菌定植与毒素（SEB）加重评估（CFU/毒素读出）。

 

6、阳性药物对照 [15]

 

单抗类药物：针对炎症因子或其受体的拮抗类单克隆抗体药物，阻断炎症因子与其受体结合，减轻炎症反应（abs190354等）。

JAKi：抑制JAK-STAT信号通路激活，抑制炎症因子的产生和作用，从而减轻 AD 的炎症反应和瘙痒症状（abs820469等）。

TRPV1 抑制剂：TRPV1 是一种非选择性阳离子通道，在角质形成细胞、肥大细胞和皮肤感觉神经中表达。以其为靶点的药物聚焦于阻断AD 患者的瘙痒信号传导（abs813134）。

芳香烃受体调节剂：芳香烃受体（AHR）是一种配体激活的转录因子，在角质形成细胞、免疫细胞（如树突状细胞、T 细胞）中高表达，参与调控皮肤屏障功能、免疫平衡及炎症反应。（abs822722）

AD治疗的新进展 [15]

 

7、质量控制与常见问题排查

 

模型成型不稳：核对原料批次（MC903/HDM）、屏障破坏强度（胶带次数/SDS浓度）、动物品系/周龄一致性；适度延长诱导周期 [1,3]。

IgE不升：优化致敏激发间隔或采用“腹腔致敏+表皮激发”路径；或切换至HDM模型 [3–4]。

RHE/FTSE表型弱：提高IL-4/IL-13剂量或延长处理；合并HDM/SEB或FLG/CLDN1敲低增强表型 [9–10]。

瘙痒行为波动大：固定时段录像、提高帧率并盲法双评；增加样本量提升统计功效。

SEB加重导致坏死：降低剂量或缩短暴露，优先观察急性转录与趋化变化 [12–13]。

 

8、安全与伦理要点

 

1）动物实验遵循机构伦理，预先进行样本量估算、随机化与盲法评分；

2）化学致敏剂（OXA/DNCB）具刺激/致敏性，DNCB为危险品，操作需注意佩戴个人防护装备并做好环境通风；

3）体外原代细胞与人源样本遵循生物安全与知情同意规定。

 

参考文献

[1] Alam, M. J., Xie, L., Yap, Y.-A., & Robert, R. (2023). A mouse model of MC903-induced atopic dermatitis. Current Protocols, 3,e695. doi: 10.1002/cpz1.695

[2] Li M, Messaddeq N, Teletin M, et al. Skin TSLP triggers Th2 responses through OX40L. Nat Commun. 2013;4:2847. doi:10.1038/ncomms3847.

[3] Martel BC, Lovato P, B?umer W, Olivry T. Translational Animal Models of Atopic Dermatitis for Preclinical Studies. Yale J Biol Med. 2017 Sep 25;90(3):389-402.

[4] Spergel JM, Mizoguchi E, Brewer JP, et al. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to methacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J Clin Invest. 1998 Apr 15;101(8):1614-22. doi: 10.1172/JCI1647.

[5] Zeng L, Liu Y, Xing C, et al. Saponin from Periploca forrestii Schltr Mitigates Oxazolone-Induced Atopic Dermatitis via Modulating Macrophage Activation. Mediators Inflamm. 2020 Oct 15; 2020:4346367.  doi: 10.1155/2020/4346367.

[6] Matsuda H, Watanabe N, Geba GP, et al. Development of atopic dermatitislike skin lesions with IgE hyperproduction in NC/Nga mice. Int Immunol. 1997;9(3):461–466. doi:10.1093/intimm/9.3.461.

[7] Saunders SP, Goh CS, Brown SJ, et al. Tmem79/Matt is a predisposing gene for atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2013 Nov; 132(5):1121-9. doi: 10.1016/j.jaci.2013.08.046.

[8] Rimal R, Muduli S, Desai P, et al. Vascularized 3D Human Skin Models in the Forefront of Dermatological Research. Adv Healthc Mater. 2024 Apr;13(9):e2303351. doi: 10.1002/adhm.202303351.

[9] Danso MO, van Drongelen V, Mulder A, et al. TNF-α and Th2 cytokines induce atopic dermatitis-like features on epidermal differentiation proteins and stratum corneum lipids in human skin equivalents. J Invest Dermatol. 2014 Jul;134(7):1941-1950. doi: 10.1038/jid.2014.83.

[10] Cadau S, Gault M, Berthelemy N, et al. An Inflamed and Infected Reconstructed Human Epidermis to Study Atopic Dermatitis and Skin Care Ingredients. Int J Mol Sci. 2022 Oct 25;23(21):12880. doi: 10.3390/ijms232112880.

[11] Abaci HE, Gledhill K, Guo Z, et al. Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents. Lab Chip. 2015 Feb 7;15(3):882-8. doi: 10.1039/c4lc00999a.

[12] Lee J, Rabbani CC, Gao H, et al. Hairbearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 2020;582(7812):399–404. doi:10.1038/s41586-020-2352-3.

[13] Fa?bender S, Opitz FV, Johnen S, et al. MyD88 Contributes to Staphylococcal Enterotoxin B-Triggered Atopic Dermatitis-Like Skin Inflammation in Mice. J Invest Dermatol. 2017 Aug;137(8):1802-1804. doi: 10.1016/j.jid.2017.04.015.

[14] Choi JH, Song YS, Lee HJ, et al. The topical application of low-temperature argon plasma enhances the anti-inflammatory effect of Jaun-ointment on DNCB-induced NC/Nga mice. BMC Complement Altern Med. 2017 Jun 27;17(1):340. doi: 10.1186/s12906-017-1850-9.

[15] Schuler CF 4th, Billi AC, Maverakis E, et al. Novel insights into atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 2023 May;151(5):1145-1154. doi: 10.1016/j.jaci.2022.10.023.

 

造模相关

相关造模剂
abs820222	Calcipotriol（MC903）	维生素D类似物激活角质细胞
abs9203	鸡蛋清白蛋白（OVA）	蛋白变应原经皮致敏与/或系统致敏后激发，诱导特异性IgE与皮肤炎症
abs42065081	Oxazolone（OXA）	反复化学致敏与挑战，形成慢性苔藓样病灶。
abs04698	Recombinant Human IL-4 Protein	细胞因子体外激活炎症通路
abs04079	Recombinant Human IL-13 Protein(C-6His)	细胞因子体外激活炎症通路
abs05989	Recombinant Human IL-31 Protein	细胞因子体外激活炎症通路
abs06263	Recombinant Human IL-33 Protein	细胞因子体外激活炎症通路
abs05532	Recombinant Human TSLP Protein	细胞因子体外激活炎症通路
abs6112402	Human FLG2 Gene Knockout Kit(CRISPR)	基因敲除试剂盒，体外构建基因敲除细胞
abs50061	细胞迁移分析试剂盒（24孔板，8μM）	Transwell小室，构建体外皮肤模型
abs50062	细胞侵袭分析试剂盒（24孔板，8μM）	Transwell小室，构建体外皮肤模型
abs9932	人正常皮肤类器官培养基	皮肤类器官培养
abs9490	基质胶（标准型，含酚红）	皮肤类器官培养
abs90290	hiPSC人胚胎干细胞	皮肤类器官培养

 

检测相关

细胞因子指标检测
abs510017	Human IL-4 ELISA Kit	体液免疫Th2主导，抗寄生虫，介导过敏反应。
abs520003	Mouse IL-4 ELISA Kit
abs551003	Human IL-5 ELISA Kit	促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs552005	Mouse IL-5 ELISA Kit
abs560024	Human IL-5 Kit (HICA)	促进嗜酸性粒细胞增殖与分化，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs510003	Human IL-6 ELISA Kit	Th17标志物，参与自身免疫和炎症反应。
abs520004	Mouse IL-6 ELISA Kit
abs560025	Human IL-6 Kit (HICA)
abs560058	Mouse IL-6 Kit(HICA)
abs510004	Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit	协同 IL-12 增强 NK 细胞功能，促进 Th1 细胞分化，参与细胞免疫反应。
abs520017	Mouse CXCL1/KC (IL-8) ELISA Kit
abs560026	Human IL-8 Kit (HICA)
abs551004	Human IL-9 ELISA Kit	参与 Th2 细胞介导的免疫反应，如过敏反应。
abs552008	Mouse IL-9 ELISA Kit
abs510016	Human IL-13 ELISA Kit	调节体液免疫，参与抗寄生虫免疫和过敏反应。
abs520012	Mouse IL-13 ELISA Kit
abs510019	Human IL-17/IL-17A ELISA Kit	Th17标志物，招募中性粒细胞，抗胞外病原体，参与炎症和自身免疫疾病。
abs520009	Mouse IL-17 ELISA Kit
abs560028	Human IL-17A Kit (HICA)
abs510007	Human IFN-γ ELISA Kit	Th1型反应标志，细胞免疫主导，抗胞内病原体与肿瘤。
abs520007	Mouse IFN-γ ELISA Kit
abs560032	Human IFN-γ Kit (HICA)
abs560033	Mouse IFN-γ Kit (HICA)
abs551023	Human IgE ELISA Kit	IgE 通过参与过敏反应启动、炎症放大及与皮肤屏障功能的相互作用，影响 AD 的发生和发展
abs552210	Mouse IgE ELISA Kit
abs50186	人十二项细胞因子检测试剂盒	CBA原理，单样本单次实验可检测人十二项炎症相关细胞因子
abs50187	小鼠十一项细胞因子检测试剂盒	CBA原理，单样本单次实验可检测小鼠十一项炎症相关细胞因子

 

组织检测
abs50038	七色多重荧光免疫组化染色试剂盒（plus）（抗兔二抗）	TSA酪胺信号放大原理，多重荧光染色，单张切片可染6指标
abs957	即用型高效免疫组化二抗试剂盒	聚合物HRP二抗，信号灵敏，时间短
abs9217	苏木素-伊红（HE）染色试剂盒	HE染色试剂盒，组织形态学观察
abs90037	肥大细胞染色液（甲苯胺蓝法）	肥大细胞染色试剂
abs9756	OCT包埋剂	冰冻切片包埋剂
abs9299	抗体稀释液	抗体稀释液，提高抗体特异性
abs933	山羊血清	封闭液
abs9333	过氧化物酶封闭液（H2O2法）	淬灭内源性过氧化物酶
abs9177	中性树胶（镜检用永久封片剂）	组化，HE封片剂
abs9853	抗荧光淬灭封片剂(速干、可固化)	IF、mIHC等荧光切片封片剂

 

流式检测
细胞类型	核心表面标志物	关键胞内分子 / 功能指标
Th2 细胞	CD3?CD4?CRTH2?CCR4?	IL-4、IL-5、IL-13
ILC2	Lin?CD127?CRTH2?	IL-5、IL-13、ST2（激活标志）
嗜酸粒细胞	CD45?Siglec-8?CD16?	MBP、ECP（颗粒蛋白）
肥大细胞	CD45?CD117?FcεRI?	CD63（活化标志）、组胺
树突状细胞	cDC：CD11c?MHC-II?；pDC：CD303?	CD80/CD86（活化）、IFN-α（pDC）
abs930	人淋巴细胞分离液	PBMC收集
abs9518	大小鼠外周血淋巴细胞分离液
abs9101	红细胞裂解液（1×）
abs9475	固定剂	流式染色辅助试剂
abs9110	细胞染色缓冲液
abs9111	破膜剂

 

药物阳性对照

药物阳性对照
abs821035	Abrocitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1）
abs810404	Baricitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1, JAK2）
abs820469	Delgocitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1, JAK2, JAK3, TYK2）
abs810523	Ruxolitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1, JAK2）
abs812960	Tofacitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1, JAK3）
abs813136	Upadacitinib	JAKi抑制剂类药物阳性对照（JAK1）
abs190354	Dupilumab	IL-4R单抗药物阳性对照
abs190424	Nemolizumab	IL-31RA单抗药物阳性对照
abs190343	Secukinumab	IL-17A单抗药物阳性对照
abs190400	Tralokinumab	IL-13单抗药物阳性对照
abs190415	Lebrikizumab	IL-13单抗药物阳性对照
abs190633	Amlitelimab	OX40 配体 (OX40L) 单抗药物阳性对照
abs190631	Rocatinlimab	OX40单抗药物阳性对照
abs813134	PAC-14028 (Asivatrep)	TRPV1 抑制剂药物阳性对照
abs822722	Tapinarof	芳香烃受体调节剂药物阳性对照

 

 

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