做肿瘤/纤维化EMT研究？mIHC染色指标这么选

2025-12-08

在选择上皮间质转化（EMT）和间质上皮转化（MET）的多重免疫组化（mIHC）染色指标时，核心原则是同时标记上皮细胞标志物、间质细胞标志物及关键调控因子，通过多指标共定位分析，直观呈现细胞表型转化的动态过程（如上皮标志物丢失、间质标志物获得，或反之）。以下从指标分类、组合策略、注意事项三方面详细说明：

一、核心指标分类：上皮标志物、间质标志物、调控因子

1. 上皮细胞标志物（核心功能：指示上皮表型完整性）

用于识别细胞是否保留上皮特性，EMT过程中通常表达下调或丢失，MET过程中重新上调或恢复。

标志物	特异性与应用场景
E-钙黏蛋白（E-cadherin）	上皮细胞间黏附连接的核心蛋白，EMT的“金标准”标志物之一，几乎所有上皮源性组织均适用（如乳腺、肺、结直肠等）。
细胞角蛋白（Cytokeratins, CKs）	上皮细胞骨架特异性蛋白，常用广谱CK（如CKpan，覆盖CK1/5/6/8/10/14/18/19）或组织特异性CK（如CK7/CK20区分消化道上皮），避免与间质细胞交叉反应。
紧密连接蛋白（Occludin/ZO-1）	上皮细胞紧密连接组分，反映上皮屏障功能，适合研究EMT对组织屏障的破坏（如肺上皮、肾小管上皮）。

2. 间质细胞标志物（核心功能：指示间质表型获得）

用于识别细胞是否获得间质特性，EMT过程中表达上调，MET过程中表达下调或丢失。

标志物	特异性与应用场景
波形蛋白（Vimentin）	间质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、间充质细胞）骨架蛋白，EMT中最常用的间质标志物，与E-cadherin表达呈“负相关”，适合所有组织类型的EMT/MET检测。
N-钙黏蛋白（N-cadherin）	间质细胞（如成纤维细胞、平滑肌细胞）黏附蛋白，EMT中常与E-cadherin“切换表达”（E→N），尤其适用于肿瘤侵袭、转移相关EMT（如乳腺癌、肺癌）。
α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）	肌成纤维细胞特异性标志物，适合研究“肌成纤维细胞样EMT”（如肺纤维化、肝纤维化中的上皮细胞→肌成纤维细胞转化）。
纤维连接蛋白（Fibronectin）	间质细胞外基质（ECM）成分，EMT中上皮细胞分泌增加，可辅助反映细胞外基质重构（如肾脏纤维化、肿瘤微环境）。

3. EMT/MET关键调控因子（核心功能：解释表型转化的分子机制）

用于定位调控EMT/MET的信号分子，明确“谁在驱动转化”，通常与上皮/间质标志物共定位分析。

调控因子家族	代表分子	功能与应用场景
转录因子	Snail、Slug、Twist1/2	EMT核心转录抑制因子（直接抑制E-cadherin表达），肿瘤EMT、胚胎发育EMT的关键驱动因子，适合肿瘤侵袭前沿、纤维化病灶区域检测。
生长因子受体	TGF-βRⅠ/Ⅱ、EGFR	上游信号受体（TGF-β是EMT经典诱导信号，EGFR促进肿瘤EMT），适合研究信号通路激活与EMT的关联（如肺癌、结直肠癌）。
信号通路分子	β-catenin（核定位）	Wnt通路关键分子，核定位的β-catenin可激活EMT转录因子，适合检测“上皮细胞中β-catenin核转位”（如结直肠癌、肝癌）。

二、mIHC指标组合策略：按研究目标设计“3-4指标组合”

mIHC的优势是同时检测多个指标，需根据研究对象（肿瘤/纤维化/胚胎发育）和核心问题（仅观察表型？还是探究机制？）设计组合，避免指标过多导致信号重叠（通常一次检测3-4个指标，选择不同种属来源一抗，搭配不同荧光素二抗）。

1. 基础组合：仅观察EMT/MET表型（无机制探究）

核心逻辑：上皮标志物 + 间质标志物（必选）+ 细胞定位对照（如DAPI染核），适合快速判断“是否发生转化”。

· 通用组合（所有组织）：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（间质）+ DAPI
→ 结果判读：正常上皮细胞仅E-cadherin+，间质细胞仅Vimentin+；EMT细胞同时表达两者（“双阳性”）或E-cadherin-、Vimentin+；MET细胞则相反。
· 肿瘤特异性组合：CKpan（上皮）+ N-cadherin（间质）+ DAPI
→ 优势：CKpan特异性识别肿瘤上皮细胞，避免与正常间质细胞混淆，适合肿瘤转移灶的EMT检测。
· 纤维化特异性组合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（肌成纤维细胞间质）+ DAPI
→ 适合肺/肝/肾纤维化中“上皮→肌成纤维细胞”转化的检测。

2. 进阶组合：表型 + 机制探究（推荐）

核心逻辑：上皮标志物 + 间质标志物 + 调控因子 + DAPI，适合明确“调控因子是否驱动表型转化”。

· 肿瘤EMT机制组合：E-cadherin（上皮）+ Vimentin（间质）+ Snail（调控因子）+ DAPI
→ 结果判读：若Snail核阳性的细胞同时出现E-cadherin下调、Vimentin上调，提示Snail驱动该区域EMT。
· TGF-β通路相关组合：E-cadherin（上皮）+ α-SMA（间质）+ TGF-βRⅡ（调控因子）+ DAPI
→ 适合纤维化研究，判断TGF-β受体激活是否与上皮→肌成纤维细胞转化相关。

三、关键注意事项

1. 一抗种属与荧光素匹配：
mIHC可以选择相同种属来源的一抗；染色顺序遵循先弱后强的原则（如CKpan这种泛表达指标可以放最后一轮搭配波长最长的TSA染料）

2. 组织特异性调整：
- 避免选择与组织背景交叉的标志物（如肝脏中，CK18特异性标记肝细胞，而CKpan可能与胆管上皮交叉，需优先选CK18）；
- 间质丰富的组织（如肺、肾脏），可增加“内皮细胞标志物”（如CD31）排除内皮细胞干扰，明确Vimentin+细胞是否为EMT来源（而非正常内皮/成纤维细胞）。

3. 阳性对照与阴性对照：
- 阳性对照：已知发生EMT的组织（如肿瘤侵袭前沿、肺纤维化病灶）；已知MET的组织（如肿瘤转移灶中分化较好的区域）；
- 阴性对照：正常上皮组织（仅上皮标志物+）、正常间质组织（仅间质标志物+），以及“一抗替代对照”（用同型IgG替代特异性一抗，排除非特异性染色）。

4. 结果量化指标：
仅观察“阳性/阴性”不够，需通过图像分析软件（如ImageJ、QuPath）量化：
- EMT细胞比例：（E-cadherin-Vimentin+细胞数 + E-cadherin+Vimentin+细胞数）/ 总上皮细胞数；
- 共定位系数：调控因子（如Snail）与间质标志物（如Vimentin）的共定位Pearson系数，判断两者是否协同表达。

综上，EMT/MET的mIHC指标选择需围绕“表型识别（上皮 + 间质）+ 机制验证（调控因子）”核心，结合研究对象调整组合，并严格控制对照与量化分析，才能准确反映转化过程及分子机制。

小爱mIHC服务即染指标

组织	人（免费提供抗体使用）	小鼠（免费提供抗体使用）
T细胞	CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103、CD69	CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD45、CD103、CD69
巨噬细胞	CD68、CD163、CD206、CD86、M-CSF、CD14、CSF-1R	F4/80、CD68、CD86、CD11b、CD163、M-CSF、CD206、CSF-1R
免疫检查点	PD-1、PD-L1、HLA-DR、TIM-3、GZMB、CD24、LAG-3、B7-H3/CD276	GZMB、PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG-3
神经细胞	IBA1、GFAP、NeuN	IBA1、GFAP、NeuN
成纤维细胞	α-SMA	α-SMA
肿瘤相关	Ki-67、PANCK、VEGF、SHP-2、Arginase-1、EGFR、TTF-1、MUC1、p63、p40、CDX2、PCNA、EPCAM、GST-π、HER2、CK7、CK8、CK18、CK5/6、CK20、GATA-3	SHP-2、Arginase-1、Ki-67、PANCK、PCNA、EPCAM、GST-π、EGFR、GATA-3
NK细胞	CD56、T-bet	NKR-P1C(NK1.1)、CD56、T-bet
B细胞（浆细胞）	CD20、CD21、CD23、CD19、CD24、CD80、CD138	CD20、CD21、CD23、CD19
内皮细胞	CD31、ICAM-1	CD31
间充质细胞	Vimentin	Vimentin
细胞因子	IL-4、IL-10、CXCL13、CCL2、TNF-α	TNF-α
中性粒细胞	CD66b、CXCR2、CD15	LY6G、CXCR1、CXCR2
树突状细胞	CD11b、CD11c	CD11b、CD11c
更多指标	Napsin A、Trem2	Arrestin-C、iNOS、Trem2

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