PI染色液：原理、应用与实验指南

在细胞生物学研究中，PI染色液作为一种经典的荧光染料，在细胞活力检测、凋亡分析和细胞周期研究中发挥着不可替代的作用。本文将全面介绍PI染色液的技术特点、应用场景和实验操作方法，为研究人员提供详细的实验参考。

1. PI染色液概述

1.1 基本定义与特性

PI染色液，主要成分为碘化丙啶（Propidium Iodide），是一种DNA结合性荧光染料，能够嵌入双链DNA的碱基对之间并与核酸结合。这种结合几乎没有序列偏好性，大约每4-5个碱基对结合一个PI分子。

PI的分子式为C27H34I2N4，分子量为668.39，CAS号为25535-16-4。它在水溶液中的最大激发/发射波长为493/636nm，但当与核酸结合后，其荧光信号会增强20-30倍，最大激发波长变为535nm，最大发射波长变为617nm。

1.2 独特的工作机制

PI最显著的特性是它的非细胞膜渗透性。它不能穿过活细胞完整的细胞膜，只能通过细胞膜破损的区域进入细胞内部。这一特性使得PI能够特异性地染色细胞膜完整性丧失的坏死细胞或晚期凋亡细胞，而活细胞和早期凋亡细胞则不被染色。

2. PI染色液的主要应用领域

2.1 细胞活力与细胞死亡检测

PI染色液最常见的应用是区分活细胞和死细胞。在流式细胞分析中，通过PI染色可以轻松识别和排除死细胞，提高检测结果的准确性，因为死细胞可能会与抗体发生非特异性结合，产生假阳性结果。

在细胞凋亡研究中，PI常与Annexin V联用，形成Annexin V/PI双染色法，成为检测和量化凋亡细胞的金标准方法。在这种方法中：

• Annexin V+/-/PI-：活细胞
• Annexin V+/PI-：早期凋亡细胞
• Annexin V+/PI+：晚期凋亡细胞
• Annexin V-/PI+：坏死细胞

2.2 细胞周期分析

PI染色液也可用于细胞周期分析，通过检测细胞DNA含量，将细胞分为G0/G1期、S期和G2/M期。进行细胞周期分析时，PI通常需要与RNase A一起使用，以排除RNA对DNA定量分析的干扰。

在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前会出现一个亚二倍体峰（sub-G1峰），这是识别凋亡细胞的重要标志。

2.3 细胞核染色与荧光成像

在荧光显微镜观察中，PI可作为细胞核复染剂，提供红色荧光的细胞核信号。它适用于多种样品类型，包括：

• 细胞涂片
• 石蜡切片
• 冰冻切片
• 染色体标本

3. 实验操作方法

3.1 染色工作液的配制

不同供应商的PI染色液浓度不同，使用前需要适当稀释：

• 对于50X的储存液，可按每100μl细胞重悬液加入2μl的比例使用
• 也可用PBS将PI染色液50-200倍稀释后使用

部分供应商提供浓度为1mg/ml的PI储存液，使用时需用相应缓冲液稀释到工作浓度。

3.2 样品染色流程

荧光显微镜检测流程：

1. 收集细胞，PBS洗涤一次，离心重悬，调整细胞浓度至约10?个/ml
2. 取100μl细胞悬液，加入2-10μl PI染液，轻轻混匀
3. 4℃避光孵育5-20分钟
4. 滴加于载玻片，加盖玻片后观察

流式细胞仪检测流程：

1. 收集细胞，PBS洗涤一次，离心重悬
2. 在500μl细胞悬液中加入5μl PI染液
3. 4℃避光孵育15-30分钟
4. 上机检测

3.3 关键参数与优化建议

• 避光操作：PI是光敏物质，整个染色过程应在避光条件下进行
• 染色时间：根据样本类型调整，通常5-20分钟
• 温度控制：多在室温或4℃下染色
• 及时检测：染色后应尽快检测，时间过长可能导致坏死细胞数量增加

4. 结果解读与分析

4.1 荧光显微镜观察

在荧光显微镜下，使用488nm激发光观察：

• 正常细胞：不被PI染色，无红色荧光
• 早期凋亡细胞：呈现微弱红色荧光
• 晚期凋亡细胞：红色荧光加强
• 坏死细胞：呈现强红色荧光

4.2 流式细胞仪分析

流式检测时，使用488nm激发光，检测大于630nm的发射光。分析时应注意：

• 使用前散射光（FSC）与侧散射光（SSC）散点图设门，排除细胞碎片和聚集细胞
• 凋亡细胞通常表现为FSC降低，SSC可能升高或降低
• 在PI荧光直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现亚二倍体峰

5. 注意事项与常见问题

5.1 安全与保存

• 安全性：PI是已知的诱变剂，操作时应穿戴实验服和手套，废弃物需经活性炭处理后再丢弃
• 保存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融
• 稳定性：正确条件下可保存至少一年

5.2 实验优化

• 对照设置：每次实验都应设置未染色对照和阳性对照（已知的死细胞样品）
• 染料浓度：初次使用建议进行梯度实验，确定最佳染色浓度
• 多色分析：PI的红色荧光与其他荧光染料（如FITC、PE等）搭配时，需注意荧光补偿调整
• RNA干扰：进行DNA含量分析时，需用RNase A处理样品，避免RNA干扰

5.3 故障排除

• 背景过高：可能是染料浓度过高或清洗不充分
• 信号弱：检查染料活性、染色时间或细胞膜通透性
• 结果不一致：确保细胞活性良好，避免微生物污染

6. 总结

PI染色液作为一种经济实用、操作简便的荧光染料，在细胞生物学研究中具有广泛的应用价值。通过特异性地标记死细胞和晚期凋亡细胞，它在细胞活力检测、凋亡分析和细胞周期研究中发挥着关键作用。掌握PI染色液的正确使用方法和结果解读技巧，将有助于研究人员获得更准确、可靠的实验数据。

随着多色荧光分析技术的发展，PI与其他荧光探针的组合使用将进一步拓展其应用范围，为细胞状态评估提供更全面的信息。

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