小鼠肺癌组织-单细胞样本制备标准protocol

一、实验前准备?全套试剂耗材

组织样本处理?所用全套试剂耗材

二、样本取材及预处理

小鼠鼠肺癌免疫细胞分离步骤

? 将获取的新鲜肿瘤组织浸泡在预冷的组织保存液中，4℃保存及运输；

? 将肿瘤组织转移至含有预冷1×PBS缓冲液（abs962）进行清洗，并尽量去除肿瘤组织表面脂肪和结缔组织；

三、标准化组织解离步骤参考

1、组织消化解离

? 将清洗过的组织，剪碎成0.5?1 mm3左右的组织块，将组织块（约100 mg）转移至5 mL的离心管中，并加入1 mL解离液，将离心管置于37℃恒温培养箱中孵育30 min，每隔10 min可以上下颠倒离心管；孵育结束后，可以将解离好的组织混合液使用1 mL移液器缓慢吹打10?20次（注：尽量将组织剪碎，这样有助于解离液与组织充分接触，更好消化组织）；

? 将孵育好的细胞悬液使用70 μm细胞筛网过滤至新的50 mL离心管中，加入3?5 mL含有10% FBS的RPMI?1640培养基缓冲液冲洗筛网并过滤；

2、Percoll密度梯度液配置（40%、80%）

40%Percoll溶液：Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100%Percoll母液。用100%Percoll母液和 RPMI1640/1×PBS按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液。

80%Percoll溶液：Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100%Percoll母液。用100%Percoll母液和 RPMI1640/1×PBS按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液。

3、Percoll 密度梯度提取目的细胞

? 将上述得到的细胞悬液在4℃，400 g条件下离心5 min，弃去上清，用4 mL的40% Percoll重悬细胞沉淀；

? 吸取2.5 mL的80% Percoll深入到新的15 mL离心管底部，试管稍微倾斜，将4 mL的40% Percoll与细胞的混悬液沿着管壁缓慢加入15mL离心管中，覆盖在80% Percoll溶液上面形成密度梯度；（注：不要破坏80%Percoll和40%Percoll与细胞混悬液的分界面，40%和80%Percoll现配现用。）

? 室温条件下800 g离心20 min，升速1，降速0；

? 离心结束后吸取中间层细胞至新的15mL离心管中，加入预冷的1×PBS缓冲液（abs962），上下颠倒混匀，4℃条件下400 g离心5 min，弃去上清；

? 细胞沉淀使用适量的细胞染色缓冲液（abs9475）重悬，得到的细胞悬液可用于后续实验操作。

四、流式结果展示

试剂盒将小鼠肺癌组织处理为单细胞悬液后AO/PI计数结果

试剂盒将小鼠肺癌组织处理为单细胞悬液后流式检测细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8a、CD11b、F4/80、Ly6C、Ly6G、CD326、CD31染色结果

实验所用试剂耗材