WB结果图有问题？有时候还真不能怪抗体

2020-04-13

免疫印迹，通常也叫Western Blot，是一种蛋白研究的基本技术，虽然每个实验室都有自己的方法，但基本的步骤大致相同，然而有个别老师做完实验得不到满意的实验结果，会来和小爱抱怨抗体问题，其实很多问题可能是一些实验的小细节在搞破坏，这里小爱为大家罗列了一些常见的WB实验的“破坏”分子，希望老师们都可以做出满意的结果！

1、转膜不充分

可能的原因	验证或解决方法
膜没有完全均匀湿透	使用100%甲醇浸透膜
靶蛋白分子量小于10kDa	选择小孔径的膜，缩短转移时间
靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值	可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（PH10.5）或使用低PH值缓冲液如乙酸缓冲液
甲醇浓度过高	过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移，降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替
转移时间不够	对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间

2、背景高

可能的原因	验证或解决方法
膜没有完全均匀湿透	使用100%甲醇浸透膜
洗膜不充分	增加洗液次数和洗液体积
封闭不充分	增加封闭液孵育时间，或者提高温度，选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BS，,酪蛋白等）
二抗浓度过高	降低二抗浓度
检测过程中膜干燥	保证充分的反应液，避免出现干膜现象
曝光过度	缩短曝光时间
抗体与封闭蛋白有交叉反应	检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂，洗涤剂中加入Tween-20可减少交叉反应
二抗的非特异性背景	增加一个二抗对照：不加一抗，其它条件不变，即可验证背景是否有二抗系统来源。选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）

3、无信号

可能的原因	验证或解决方法
抗体染色不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
酶失活	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明失活，选择在有效期内有活性的酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白蛋白太低	设置阳性对照，如果阳性对照，
试剂之间不匹配	一抗与标本种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配，通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效	选择有效期内抗体，并选择现配现用的工作液
HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠

4、弱信号

可能的原因	验证或解决方法
抗体染色不充分	增加抗体浓度，延长孵育时间
酶活性降低	直接将酶和底物进行混合，如果显色弱则说明酶活性降低了。选择在有效期内，有活性的酶联物
标本中靶蛋白含量太低	增加标本上样量
洗膜过度	缩短洗涤时间和次数
抗体活性降低	选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置
封闭过度	较少封闭剂的量或缩短时间；更换不同封闭类型
曝光时间过短	延长曝光时间
HRP抑制剂	所用溶液和容器中避免含有叠氮钠

5、非特异性条带（多条带）

可能的原因	验证或解决方法
二抗的非特异性结合	增加一个二抗对照（不加一抗，其它操作不变）即可验证背景是否由二抗系统来源；选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）
蛋白降解	使用新鲜制备的抗体，并使用蛋白酶抑制剂
抗体浓度过高	降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带
不同剪切体的存在	有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方法，每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
细胞传代过多导致蛋白变异	使用原代或传代的细胞作对照
蛋白上样量过大	降低上样量

6、条带大小不对

可能的原因	验证或解决方法
二聚体或多聚体存在	增加蛋白质变性过程及强度
翻译后剪切	比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能是需要进行剪切成活化的形式，如procaspases
蛋白修饰	比如氨基化、磷酸化等修饰状态回导致蛋白分子量增加

7、背景有黑色斑点

可能的原因	验证或解决方法
封闭试剂中有聚集体	使用前过滤封闭试剂
孵育液中有聚集体	使用前过滤孵育液
抗体和封闭试剂反应	使用前过来吧封闭试剂
HRP偶联二抗中有聚集体	过滤二抗试剂

8、背景有不均匀的白色斑点

可能的原因	验证或解决方法
转膜过程中有气泡产生	仔细检查，避免存在气泡
抗体分布不均匀	孵育抗体时使用摇床

9、微小条带

可能的原因	验证或解决方法
电泳速度过快	减少电压减慢电泳速度
电泳速度过高	在冷室或冰浴中进行电泳，改变电泳PH值

10、膜出现反像（白色带）

可能的原因	验证或解决方法
HRP含量过高	降低酶联二抗浓度

11、Marker变黑色

可能的原因	验证或解决方法
抗体和marker蛋白反应	在marker和sample之前空出一个孔不上样

爱必信4月大促开启！经典产品6折团购，其中有两款经典的WB产品，ECL发光液（）和marker（abs924、）

货号	品名	规格	促销价
abs50001	Annexin V-FITC apoptosis assay kit	50T/100t	630/1102.80
abs920	ECL化学发光检测试剂盒	2*250ml	693
abs922	预染蛋白marker, 10-180kDa	500ul	492
abs924	预染蛋白marker, 10-180kDa	2×250ul	372
abs923	预染蛋白marker	500ul/5*500ul	600/2400

爱必信特色产品线（全部现货）：二抗、标签抗体、对照抗体；WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；细胞因子、信号通路调节剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒、呼吸爆发试剂盒；动植物提取物，定制服务(抗体/多肽/蛋白)...