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公司动态

动物脑类器官培养全攻略

2025-01-16

流程

 

类器官原代培养流程

 

原代

 

一、准备工作

 

1、仪器设备

CO2培养箱、双人单面超净台、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅(abs72023)或水浴摇床,医用冰箱、-80℃冰箱、移液器(一套)、眼科剪、眼科镊

 

2、试剂耗材(以肠癌为例)

动物脑类器官培养基试剂盒(abs90050),基质胶(低因子、无酚红)(abs9495),60mm细胞培养皿(abs7005), 100μm滤筛(abs7009),15mL离心管(abs7102),1.5mL EP管若干(abs7119),24孔细胞培养板(abs7035)、金属冰盒、眼科剪刀、眼科镊

 

 

组分名称

规格

动物脑类器官培养基A

100mL

类器官原代培养缓冲液B

250mL

原代组织消化液C

30mL

类器官传代消化液D

30mL

组织保存液E

100mL

类器官冻存液F

20mL

类器官传代培养缓冲液G

250mL

 

二、操作流程

 

1、样本准备

(1)将组织放入含有预冷的(2-8°C)组织保存液E的取样瓶中(浸没整个组织),4℃从医院/实验室取回;

(2)将取样瓶消毒,组织取出放入培养皿样本拍照,并登记,大小,颜色,软硬程度,组织类型等信息。

 

 

2、清洗-剪碎

(1)在60mm细胞培养皿(abs7005)里用2-3mL原代培养缓冲液B浸泡。用原代培养缓冲液B清洗三次(每次更换培养皿)后剪碎,剪成大约1-3mm3的组织块转移至15mL离心管。

 

 

3、消化-过滤

(1)向15mL离心管中加入5倍原代组织消化液C(消化液体积:组织体积=5:1,如果估量组织体积困难,使用5mL消化液通常足够)37℃进行消化15-30min(消化过程中随时观察消化情况)

(2)取少量液体在显微镜下观察,镜下观察到较多的细胞团(5-50个细胞抱团)后, 加入3倍体积原代培养缓冲液B(缓冲液体积:消化液体积=3:1终止消化,用枪头轻柔吹打可以看到液体变浑浊。

 

 

(3)使用100μm滤筛(abs7009)进行过滤,取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15mL离心管,于300g 4℃富集离心5min后移去上清。

 

 

4、加胶-点板-加液(这里是整个原代操作的点睛之笔)

 

(1)准备工作

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完。

 

低温金属冰盒(abs7289)

 

(2)接种要求

24孔板(abs7035),每孔25uL基质胶细胞团混合物,500-750uL类器官培养液。

 

(3)接种密度

密度建议1:基质胶体积:细胞团沉淀体积=25:1(如果估摸细胞团沉淀体积困难,通常加300uL基质胶足够)

密度建议2:500个细胞团/25uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

(5)加液

将铺好的培养板放入37培养箱中40-60min成胶添加500-750μL类器官培养基A进行培养大概10-14天,多数类器官直径在200um-500um,可进行传代操作。

 

铺板密度

 

传代(消化分两种情况

 

一、类器官数量较多或体积较大传代步骤

 

1、类器官收集及洗涤

 

(1)收集:移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组)。

 

 

(2)洗涤:加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了

 

(3)接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

 

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶类器官混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g),离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

2、类器官消化

 

(1)添加2-3mL类器官传代消化液D于超净台内消化2-3min,消化期间吹打1-2次。此步骤以消化成细胞团为主,千万不要消化成单细胞,单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜,可吸取数微升镜下观察,如果有较多细胞团可停止消化。

 

(2)添加5倍类器官传代培养缓冲液G(缓冲液:消化液=5:1)终止消化,300g 4℃离心5min弃去上清(如果有基质胶残留,残留量<50uL正常,不影响传代类器官增殖)

 

 

3、加胶-点板-加液

 

(1)准备工作

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完。

 

(2)接种要求

24孔板(abs7035),每孔25uL基质胶细胞团混合物,500-750uL类器官培养液。

 

(3)接种密度

密度建议1: 类器官通常按1:2传代,例如,24孔板收集5孔,传代10孔,需要的基质胶量25*10=250uL

密度建议2:500个细胞团/25uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

注意:不管是按密度建议1还是,密度建议2,如果有残留的基质胶,新胶量至少是残留胶量的1.5倍。

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

(5)加液

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶,添加500-750μL人肠癌类器官培养基A进行培养。大概10-14天,多数类器官直径在200-300um,可进行传代操作。

 

 

二、类器官数量不足或体积较小时:

 

1、类器官收集、吹打、洗涤

 

(1)移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶

(2)进行吹打,将类器官吹成细胞团(可取样镜下观察有较多细胞团时可停止吹打)

(3)洗涤: 24孔板,每5孔为一组,收集在15mL离心管中,加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了

(4)接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留细胞团沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶细胞团混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶细胞团混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g),离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

2、加胶-点板-加液

 

(1)准备工作

a 基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

b 枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

c 融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完。

 

(2)接种要求

24孔板(abs7035),每孔25uL基质胶细胞团混合物,500-750uL类器官培养液。

 

(3)接种密度

密度建议1: 对于类器官数量较少的情况,为了维持生长所需的旁分泌信号,需要2-3孔富集到1孔,例如,24孔板收集6孔,2孔富集1孔,铺3孔,需要的基质胶量25*3=75uL

密度建议2:500个细胞团/25uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)

注意:不管是按密度建议1还是按密度建议2,如果有残留的基质胶,新胶量至少是残留胶量的1.5

 

(4)加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

(5)加液

将铺好的培养板放入37培养箱中40-60min成胶添加500-750μL类器官培养基A进行培养。大概7-10天,多数类器官直径在200-300um,可进行再次传代。

 

冻存

 

冻存要领:

类器官不需要消化(消化后的类器官复苏活率低);

在类器官指数增长期冻存(等到该传代的时候类器官活性比指数期差),也就传代后的Day3-Day4,多数类器官直径在100um-200um,这个时机选择冻存。

 

一、类器官收集及洗涤

 

1、收集:移液器吸去培养基,每孔添加1-2mL左右4℃类器官传代培养缓冲液G,轻柔吹散基质胶,收集在15mL离心管中(24孔板,每5孔为一组)

 

 

2、洗涤:加类器官传代培养缓冲液G定容至14mL(缓冲液越多,基质胶被稀释的越充分,越容易去除),4℃静置40min或-20℃放置5min(目的是使基质胶软化,如果冰箱保温效果强,缩短冷冻时间,摸索合适的冷冻时间时,可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了

 

3、接下来将离心管进行300g,4℃,离心5min,离心完通常会有这两种情况:

 

第一种是正常情况,分成三层(如下图),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。

 

 

第二种是不正常情况,分成两层(如下图),这种情况可能与冷化不充分有关。此时弃掉缓冲液,留下基质胶类器官混悬液,重复上一步洗涤步骤,再次冷化离心,通常能出现清晰分层(缓冲液层、基质胶层、类器官沉淀层),此时弃掉上清和基质胶层,保留类器官沉淀即可。如果依然是两层(缓冲液层和基质胶类器官混悬液层),此时弃掉缓冲液和上1/3的基质胶类器官混悬液,保留下2/3即可。

 

 

促进基质胶和类器官有效分离条件:

a 离心机的选择非常重要,水平角离心机相比固定角离心机更利于基质胶和类器官分离;

b 离心机的温度最好是4℃(可避免基质胶固化),离心转速可适当提高(最高不要超过500g),离心时间可适当加长(最常不超过10min)。

 

二、类器官冻存

 

1、冻存密度,以24孔板为例

密度建议12/mL冻存液

密度建议2500个类器官/mL冻存液(如果想计数冻存,可以参照此密度建议)

 

2、添加适量类器官冻存液F,轻柔吹打重悬,建议立即进行冻存。(放置太久,DMSO对类器官有损伤)

 

3、梯度冻存:将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

     手动冻存:4℃冰箱放置30min,转移至-20℃放置1h,然后移至-80℃过夜,第二天取出放入液氮罐。

 

复苏

 

一、实验前准备

 

1、将水浴锅预热至37℃;

2、细胞实验室进行常规消毒,用预防喷雾喷涂并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面;

3、在超净工作台中按次序摆好消过毒的离心管、吸管、培养板等。

 

二、取出冻存管

 

1、根据类器官冻存记录按标签找到所需类器官的编号;

2、从液氮罐中取出冻存盒,取出所需的冻存管,同时核对冻存管外的编号。

 

三、迅速解冻

 

1、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻,并要不断地摇动,使管中地液体迅速融化;

2、约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用酒精棉球擦拭冻存管地外壁,再拿入超净台内。

 

四、将类器官冻存液移入15mL离心管,添加10倍体积类器官传代培养缓冲液G(缓冲液体积:冻存液体积=10:1重悬,轻柔吹打混匀,300g 4℃离心5min,弃上清。

 

五、加胶-点板-加液

 

1、准备工作

 

(1)基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化;

(2)枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时;

(3)融化后的基质胶可一直放4℃储存,建议2周内用完。

 

2、复苏要求

 

24孔板(abs7035),每孔25uL基质胶类器官混合物,500-750uL类器官培养液。

 

3、复苏密度

 

复苏密度建议1:1:1接种(原来冻几孔就复苏几孔);

复苏密度建议2:250个类器官/25uL基质胶(如果想计数接种,可以参照此密度建议)。

 

4、加胶-点板

 

向类器官沉淀加入基质胶(abs9495),进行吹打混匀(不要满吹满打,容易产生气泡),然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后,加胶,混匀,点板控制在半分钟内,有利于保持基质胶良好的流畅性。

 

5、加液

 

将铺好的培养板放入37培养箱中40-60min成胶添加500-750μL类器官培养基A进行培养大概10-14天,多数类器官直径在200um-500um,可进行传代操作。

 

6、脑类器官鉴定图

 

 

今天讲解就到这了,大家如有实验问题,欢迎一起交流哦!

 

本期小爱推荐

货号

品名

规格

abs9449

Organotial人胃癌类器官培养基试剂盒

1kit

abs9495

基质胶(低因子,无酚红)

1.5ml*8

abs7289

2mL低温金属冰盒(24孔,平底)

1个

abs7005

60mm细胞培养皿

1箱

abs7233

100μm滤筛

1箱

abs7164

细胞冻存管

1箱

abs7035

细胞培养板(标准透明24孔板)

1箱

abs7119

1.5mL EP管若干

1箱

abs7102

15mL离心管

1箱

abs7100

50mL离心管(尖底)

1箱

abs7053

10mL一次性移液管

1箱

abs7054

25mL一次性移液管

1箱

 

Absin产品线:

爆款产品:十大试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测);细胞培养(类器官试剂盒+基质胶,胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒;分子(mRNA合成服务+提取试剂盒);化合物大包装;辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

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