IPS诱导肠类器官培养攻略（第一阶段）

IPS诱导肠类器官培养分为三大阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、类器官培养。

人多能干细胞的培养

一、实验准备：

1、人多能干细胞培养基配制

（1）2-8℃解冻hPSC Medium Supplement，融化后上下晃动混匀，按实际用量进行分装，立即使用或储存于-20~-80℃，避免反复冻融；

（2）按1:50的比例将hPSC Medium Supplement(10mL)加入到hPSC Medium Basal Medium(500mL)中，混合均匀即成为人多能干细胞培养基(abs9403)。

注意：混匀后的人多能干细胞培养基可在2-8℃稳定储存2-3周，不建议使用配制已超过3周的人多能干细胞培养基。

（3） 实验试剂平衡：人多能干细胞培养基实验前放置室温避光平衡；PBS，消化液等 37℃加热。

注意：培养基中含有因子，不要37℃水浴加热。

二、操作方法(以下步骤皆应在无菌条件下操作)

hPSC细胞复苏：

1、实验操作步骤：

1.1、基质胶包被培养板：取出6孔板/12孔板，每孔内加入1mL/0.5mL基质胶(abs9410)，轻轻晃动6孔板/12孔板使基质胶完全覆盖皿底，置于37℃培养箱中孵育1h~2h，实验前拿出并置于超净工作台/生物安全柜中室温下平衡20min。如果暂时不用，可用Parafilm封口后2-8℃储存，并于1周内使用。

注意：

①一支冻存的干细胞的数量在1×10⁶cells/mL左右，对应6孔板1孔；

②即用型基质胶对温度敏感，即用即拿，用完后立即放回4℃冰箱保存，且勿用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，影响基质胶质量。

1.2、先将2~3mL的干细胞培养基加入15mL离心管中备用。

1.3、解冻：将从液氮中取出的冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动，使其在1~2min内快速解冻；

注意：细胞从液氮中拿出的速度要快，尽量减少其暴露在室温中的时间。

1.4、离心：冻存管中的冻存液解冻后，将其逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，将15mL离心管置于低速离心机中配比平衡后，1000rpm离心3min；

1.5、重悬：离心后弃上清加1mL人多能干细胞培养基对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次左右。

1.6、接种：吹吸均匀后，将已经平衡好的即用型基质胶弃掉，将吹打均匀的干细胞悬液加入到已经包被好的6孔板中，并补全每孔2mL培养体系。

1.7、培养：接种后的6孔板可以置于倒置相差显微镜下观察接种的干细胞密度以及细胞团块大小，呈4个细胞以上的团块较合格，水平十字轻轻晃动6孔板/12孔板使细胞均匀分布。并置于37℃，5%CO₂的恒温培养箱培养，第2天观察细胞贴壁情况；

1.8、换液：从复苏的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞(PSCs)集落

hPSC 细胞传代：

2、实验具体操作步骤：

2.1、清洗：吸掉原有培养基，贴壁缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻晃动，然后沿培养皿边缘吸去PBS缓冲液；

2.2、消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液(abs9409)使之覆盖皿底，并置于37℃培养箱中2~5min；

注意：消化时间依据干细胞生长密度，消化时间略有不同，根据经验一般建议时间2-5min。消化过程中可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况，若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙，即可吸掉消化液终止消化。

2.3、吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，用移液枪扇形吹打培养皿底，轻柔吹打3~5次，使皿底干细胞集落脱落，并将其并转移到15mL离心管中；

注意：吹吸皿底细胞的力度要轻柔，吹打脱落和吹吸混匀的次数在3~5次为宜，尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

2.4、离心：1000rpm离心3min，弃上清；

2.5、接种：用干细胞培养基吹打细胞5-10次，吸掉包被培养板中的基质胶，并将细胞悬液加入到培养板中，且补全每孔2mL的培养体系。

注意：吹打细胞要温柔，并且吹打次数不要超过10次。

2.6、换液：从传代的时间开始每24h换液一次。

注意：因培养基中活性成分只足够维持一天，所以每24h应及时更换新鲜培养基。

多能干细胞(PSCs)集落染色图

hPSC细胞冻存

3、实验具体操作步骤：

3.1、清洗：同2.1；

3.2、消化：同2.2；

3.3、吹打：同2.3；

3.4、离心：同2.4；

3.5、重悬：离心后弃上清，加入2mL ES/iPS细胞冻存液(abs9412)对干细胞沉淀进行吹吸混匀，吹吸3~5次后，将其加入到冻存管中；

注意：冻存液即用即拿，及时放回4℃冰箱。

3.6、记录：在冻存管上标记冻存细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

3.7、-80℃冰箱冻存：冻存管置于-80℃冰箱过夜。

注意：冻存管放置于-80℃冰箱时，要将冻存管直立放置，切忌冻存管斜放或横放。

3.8、液氮冻存：24h后将-80℃冰箱中的细胞转移至液氮中长期冻存。

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