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产品描述: 产品名称:Caspase 3/7活性检测试剂盒 描述: Caspase 3/7 活性检测试剂盒(Caspase 3/7 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3/7酶活性或纯化的caspase 3/7酶活性的试剂盒。
Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain,有时被写作caspase-3或caspase 3,属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3 subfamily),是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究 一个caspase。Caspase 3和Caspase 7都可以剪切DEVD肽段序列,因此本试剂盒可以检测caspase3/7。
本试剂盒是基于Caspase 3/7可以催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色的pNA (p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3/7的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时,除标准曲线外可以检测20个样品(20T)或者100个样品(100T)。
产品组分: | 名称 | 20T | 100T | | 裂解液(Lysis buffer) | 8ml | 30ml | | 检测缓冲液(Assay buffer) | 8ml | 20ml | | Ac-DEVD-pNA(2mM) | 200ul | 1ml | | pNA(10mM) | 200ul | 1ml | 别名: CPP32;Yama;apopain;caspase-3;caspase 3 使用方法: 使用说明:
1. 准备工作:
a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2. 测定pNA标准曲线:
a. 标准品稀释液的配制:按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。
b. 把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM,作为标准品。
c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测,或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测,测定A405。
d. 每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度,并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。
3. 样品的收集:
a. 对于悬浮细胞:把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品,600g 4oC离心5分钟收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
b. 对于贴壁细胞:吸取细胞培养液,备用。用胰酶消化贴壁细胞,并收集至备用的细胞培养液中。600g 4oC离心5分钟收集细胞,小心吸除上清,同时确保尽量没有细胞被吸除,PBS洗涤一次。同前吸尽上清后,按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液,重悬沉淀,冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
c. 对于组织样品:按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中,冰浴再裂解5分钟。
d. 4oC 16,000-20,000g离心10-15分钟。
e. 把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
f. 立即测定caspase 3/7的酶活性或-80oC保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml,相当于每10微升待测样品中至少含有10-30μg蛋白。如果细胞较少,可以适当增加细胞的用量。
4. Caspase 3/7酶活性的检测:
a. 取出适量的Ac-DEVD-pNA (2mM),置于冰浴上备用。
b. 如下设置反应体系:
| 名称 | 空白对照 | 样品 | | 检测缓冲液 | 40μl | 40μl | | 待测样品 | 0μl | 50μl | | 裂解液 | 50μl | 0μl | | Ac-DEVD-pNA (2mM) | 10μl | 10μl | | 总体积 | 100μl | 100μl | 注意:在设置反应体系时先加检测缓冲液,再加待测样品,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μl Ac-DEVD-pNA (2mM)。
c. 加入Ac-DEVD-pNA (2mM)后混匀,注意避免在混匀时产生气泡。37oC孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。
d. 样品的A405扣除空白对照的A405,即为样品中caspase 3/7催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。
e. 参考Chemicon公司的caspase 3/7酶活力单位的定义:One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37oC under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时,在37oC一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3/7的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3/7。说明:在本试剂盒的检测体系中,底物的起始浓度为0.2mM,此时底物是饱和的,对于许多样品而言在37oC孵育2个小时以内底物都是饱和的;对于样品中caspase 3/7酶活力特别高的情况,须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。
f. 用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT,不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3/7的酶活力单位。
储存/保存方法: -20℃保存,Ac-DEVD-pNA和pNA需要避光保存。有效期12个月。 产品信息订购:
| 产品货号 | 产品名称 | 规格 | 价格 | 大包装及货期 | | abs50025 | Caspase 3/7活性检测试剂盒 | 20T | 735.00 | 立即咨询 | | abs50025 | Caspase 3/7活性检测试剂盒 | 100T | 2100.00 | 立即咨询 | 产品更多信息请进入爱必信网站咨询
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