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产品描述:

产品名称:人间充质干细胞成骨诱导试剂盒

描述:

        间充质干细胞(MSC)具有多向分化的潜能,体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞协会(ISCT)确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目,目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中,成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
        为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定,弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒,在稳定性、易用性上大幅改进,采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途,首先,用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力,满足MSC质量控制的要求。其次,在再生医学和组织工程研究中,诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外,诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测,如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、钙沉积量检测、免疫组化检测等。
组分:

产品特点:
小包装。采用100ml装,使用更节约、更方便;
简约装,升级产品、组成更简洁、操作更方便;
更稳定,产品系统误差更小,使用更稳定。

适用细胞类型:
人源间充质干细胞,组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。

使用方法: 一、实验准备:
 1、试剂配制:
室温融化添加物B液,将融化的溶液加入基础培养基A液中,充分混匀。
注意:混合成诱导完全培养基后必须充分混匀,2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作,各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
2、培养皿处理:
加适量包被溶液C液到培养器皿中,轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面,室温静置30-60分钟。弃去溶液 ,室温晾干。
注意:包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板,每孔加C液1 ml,使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作,避免污染。
3、自备试剂:
(1)消化液(0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 )
(2)磷酸盐缓冲液(DPBS)
(3)MSC完全培养基
(4)4%中性多聚甲醛溶液
注意:若MSC完全培养基不含血清,则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度,建议稀释0.25%胰酶消化液一倍,且严格控制消化时间。
二、操作步骤:
1、准备所需诱导分化的MSC,当细胞融合达85%左右时,用消化液消化细胞,并用MSC完全培养基重悬。
2、按照2×10⁴ cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中,每孔MSC完全培养基2 ml,37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意:细胞密度为该试剂盒的标准密度,可根据实验室情况进行调整,调整依据参照所检测MSC正常传代的密度接种,过夜培养后添加诱导培养完全培养基;或接种密度低,待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。
3、当细胞融合达60%时,弃去培养上清,每孔添加MSC成骨诱导完全培养基2 ml/孔,37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意:成骨诱导后细胞易脱壁,换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔,沿培养器皿侧壁缓缓加入,切记避免吹起细胞。
4、每3天更换新鲜的MSC成骨诱导完全培养基,持续培养2-4周。
注意:细胞状态良好一般5天后培养液出现浑浊,不可与污染混淆,换液时尽量轻柔;7-10天左右出现钙沉积。一般2周内出现较大的较厚的钙沉积,透光性变差。有些细胞钙沉积出现较晚,一般不超过3周,超过3周未出现明显沉积,请注意分析操作步骤与其他原因。可根据具体实验需求选择终止时间,但不易超过4周。具体时间请根据自己实验室细胞等条件自行确定。
5、诱导培养结束时,弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。
注意:培养结束时或中途可以选择其他检测方法,如基因表达检测等,若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自行确定。
6、弃去固定液,DPBS洗2次,加入茜素红染液1 ml/孔染色15分钟。
7、弃去茜素红染液,DPBS洗3次,添加新鲜DPBS。
注意:染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干,风干会影响显微观察效果。
8、显微镜下观察并拍照。
注意:拍照一般选用高倍镜,请根据需要确认选择。
9、结果判定:按照程序操作完毕,低倍镜下观察可见红色着色点,此处为钙,说明实验所用的MSC具有成骨能力。否则,所使用的MSC无成骨能力。

储存/保存方法: 组分A、C、D于2-8 ℃避光保存,组分B于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温,各组分在所需要的温度下有效期为1年,配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存,有效期1个月。

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