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产品描述:

产品名称:人间充质干细胞成脂诱导试剂盒

描述:

        间充质干细胞(MSC)具有多向分化的潜能,体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞协会(ISCT)确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目,目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中,成骨、成脂、成软骨也是必检指标。
        为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定,爱必信生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒,在稳定性、易用性上大幅改进,采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途,首先,用于鉴定人MSC是否具有成脂分化能力,满足MSC质量控制的要求。其次,诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测,如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、油脂定量检测、免疫组化检测等。再者,该产品诱导MSC分化为的脂肪细胞多为多泡脂肪细胞样,当脂肪滴融合过大时容易脱壁,难见单泡脂肪细胞样。用于脂肪研究可斟酌使用本产品。
产品特点:
小包装。采用100ml装,使用更节约、更方便;
简约装,升级产品、组成更简洁、操作更方便;
更稳定,产品系统误差更小,使用更稳定。
适用细胞类型:
人源间充质干细胞,组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、羊膜、皮肤、牙髓、脐带血、外周血等。
组分:

使用方法: 一、实验准备:
1、试剂配制:
(1)诱导液B:2-8℃过夜融化添加物B液,B液使用前须37℃复温30分钟,充分混匀。将基础培养基A液平均分成2份,各45 ml,加入添加物B液配制成完全诱导培养基B,充分混匀。
(2)诱导液C:2-8℃过夜融化添加物C液,加入基础培养基A液的另一份45 ml,配制成完全诱导培养基C,充分混匀。
注意:添加物B液必须充分复温,内容物充分解冻为透明无沉淀。混合成诱导完全培养基后必须充分混匀,2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作,各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。
(3)油红O染液(工作液):取油红O储液,与蒸馏水以3:2的比例混合均匀,中性滤纸过滤,即配制成了油红O染液(工作液)。油红O染色工作液现配现用。
2、培养皿处理:
加适量包被溶液D液到培养器皿中,轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面,室温静置30-60分钟。弃去溶液,室温晾干。
注意:包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板,每孔加D液1 ml,使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作,避免污染。
3、自备试剂:
(1)消化液(0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 )
(2)磷酸盐缓冲液(DPBS)
(3)MSC完全培养基
(4)4%中性多聚甲醛溶液
注意:若MSC完全培养基不含血清,则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度,建议稀释0.25%胰酶消化液一倍,且严格控制消化时间。
二、操作步骤:
1、准备所需诱导分化的MSC,当细胞融合达85%左右时,用消化液消化细胞,并用MSC完全培养基重悬。
2、按照3×10⁴ cells/cm2的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中,每孔MSC完全培养基2 ml,37℃、5%CO₂培养箱中培养。
注意:细胞密度为该试剂盒的标准密度,可根据实验室情况进行调整,调整依据参照所检测MSC正常传代的密度的2倍接种,培养24小时后添加诱导培养完全培养基;或接种密度低,待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。
3、当细胞融合达90%时,弃去培养上清,每孔添加诱导液B 2 ml/孔,37℃、5%CO₂培养。
注意:成脂诱导后细胞易脱壁,换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔,沿培养器皿侧壁缓缓加入,避免吹起细胞。细胞起始诱导融合度对诱导效果十分关键,必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。
4、诱导培养72 小时后弃去原培养上清,添加诱导液C 2 ml/孔,37℃、5%CO₂继续培养。
5、继续诱导培养24 小时后弃去原培养基,添加诱导液B 2 ml/孔,37℃、5%CO₂继续培养。
6、重复步骤4、5约3-5次,待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液C继续培养。
7、注意:一般在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡,5-9天融合为较大的亮泡,这些结构围绕在细胞核周围,较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程,若10天后仍未见脂滴结构,请注意分析操作步骤与其他原因。
8、每2天更换新鲜诱导液C,继续培养至脂滴足够大时培养结束。
注意:换液时诱导液必须经过复温,否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。根据实验需要选择培养结束时间,若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现,建议提前终止。不同实验室MSC诱导时出现脂滴的时间不尽相同,若大面积出现脂滴较早,则可提前更换为诱导液C。
9、诱导培养结束时,弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。
注意:培养结束时或中途可以选择其他检测方法,如基因表达检测等,若采用自己的检测方法则后续方案需要自己拟定。
10、弃去固定液,DPBS洗2次,加入油红O染液(工作液)1 ml/孔染色15分钟。
注意:该步骤适用于鉴定成脂能力,若出现脂滴(脂肪细胞)则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片,则染色时间需自己掌握。
11、弃去油红O染液(工作液),DPBS洗3次。
注意:油红O染色必须配制成染色工作液,否则无法着色;染色工作液现配现用。染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干,风干会影响显微观察效果。
12、显微镜下观察并拍照。
注意:拍照一般选用高倍镜,请根据需要确认选择。
13、结果判定:按照程序操作完毕,低倍镜下观察可见大面积红色着色点,20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况,此红色着色球为脂滴,说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则,所使用的MSC无成脂能力。
注意:该判定标准仅进行定性分析,若需要进行定量分析,需要自行制定方案。

储存/保存方法: 组分A、D、E于2-8 ℃避光保存,组分B、C于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温,各组分在所需要的温度下有效期为1年,配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存,有效期1个月。

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