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产品描述:

产品名称:Two-Step RT-PCR Kit

描述:

Two-Step RT-PCR Kit两步法RT-PCR试剂盒具有高效合成能力和高扩增效率。该试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板,用2×1st Strand cDNA Synthesis SuperMix进行反转录,然后用2×HotStart Taq Master Mix进行扩增。本试剂盒含有从RNA到cDNA,以cDNA为模板进行扩增的全部试剂。 

产品特点:

操作简单:操作步骤少,降低污染。

特异性高:使用HotStart Taq酶进行扩增,减少非特异性反应。 
产品组分:

实验方法:

第一链 cDNA 合成:

试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

(1)按顺序加入以下反应物:

可选步骤:如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构,可先将RNA 模板和 RNase Free Water 混匀后,65°C  孵育 5 分钟(有助于打开高级结构,便于下一步反应的进行),迅速置于冰上冷却,再加入其它组分。

(2) 轻轻混匀,离心。

(3)42°C 孵育 15-30 分钟(如果 RNA 模板中不含 poly A 结构,25°C 先孵育 5 分钟,随后 42°C 孵育 15-30 分钟)。

(4)产物可直接用于下一步反应。如果不立即使用, 可于-20°C保存一周,长时间保存建议-70°C放置。

第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

常用反应体系(20μl):

常用 PCR 循环:

当扩增片段<3K

当扩增片段≥3K(推荐引物长度≥30bp)

储存/保存方法: -20℃

注意事项: 1、本试剂盒进行PCR扩增时延伸时间为1kb/min,客户可根据具体片段长度进行延伸时间的调整。
2、如果同时操作多个样品,建议先在冰上先配制预混液,然后再分装到各个反应管中,加入模板启动反应。
3、反应扩增时出现目标条带拖带,系模板浓度过高或特异引物浓度不适等原因所致,可对模板及引物浓度等进行调整;反应出现杂带,可对退火温度进行调整,或重新设计特异性高的引物。
4、为了保证反应的正常进行,需使用高质量的RNA模板。

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