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产品描述:

产品名称:DH10BAC 感受态细胞

描述: 大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,适用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组的菌株,用于产生重组Bacmid。是经特殊工艺制备,使用pUC19质粒检测,转化效率可达107 cfu/μg,-70℃保存几个月转化效率不发生改变。
基因型:
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124
产品特点:
DH10Bac 细胞包含亲本 Bacmid bMON14272 和辅助质粒 pMON7124 亲本 Bacmid 包含一个 mini-F 复制子、卡那霉素抗性基因、att Tn7 位点和 lac Zα-互补因子。辅助质粒包含 tns ABCD 区域,该区域提供了 mini-Tn7从供体质粒插入亲本 Bacmid 靶位点所需要的转座蛋白。供体如 pFastBac 系列质粒(pFastBac1,pFastBacDual等)含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重组臂,Tn7R 和 Tn7L 之间包含庆大霉素抗性基因、昆虫病毒多角体基因启动子、多克隆位点和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信号。当含有靶基因 pFastBac 的重组质粒转化到 DH10Bac 细胞后,发生重组后就可产生重组 Bacmid,提取纯化重组 Bacmid 转染昆虫细胞 Sf9 或 Sf21 就可以包装产生昆虫病毒。此外,DH10Bac细胞中的The φ80dlacZΔM15基因的产物可以实现β-半乳糖苷酶的α-互补现象,用于重组Bacmid的蓝白斑筛选。

使用方法: 提示:1、感受态细胞应保存在-70℃,不可多次冻融和放置时间过长,以避免降低感受态细胞的转化效率。2、制备含下面抗生素的 LB 固体平板:50μg/ml kanamycin、7μg/ml gentamicin、10μg/ml tetracycline、100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG。操作:1、取感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。(一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用 DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。)以下实验以 100μl 感受态细胞为例。2、向感受态细胞悬液中加入 1-10ng 重组质粒,轻轻旋转离心管以混匀内容物,在冰浴中静置 30 分钟。3、将离心管置于 42℃水浴中放置 90 秒,然后快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却 2 分钟,该过程不要摇动离心管。4、向每个离心管中加入 900μl 无菌的 SOC(不含抗生素),混匀后置于 37℃ ,200rpm,摇床振荡培养 4 小时。5、用 SOC 培养基进行 10 倍梯度稀释,如分成 3 个稀释梯度 10-1,10-2,10-3。6、取 100ul 的各个梯度的培养物用于涂布。等平板中的液体完全吸收后,倒置平板,37℃培养 24-48 小时。7、保留剩余的菌液于 4℃冰箱中,视平板上菌落生长情况决定去留。相关试剂及培养基的制备方法:1、LB 液体培养基:称取 10g Tryptone,5g Yeast Extract 和 10g NaCl 置于 1L 烧杯中。加入约 800ml 的去离子水,完全溶解后用 2mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0。加去离子水定容至 1L。分装 后,121℃高压灭菌 20 分钟。 2、SOB和SOC 培养基:称取 20g Tryptone,5g Yeast Extract,0.5g NaCl 置于 1L 烧杯中加入约 800ml 的去离子水,完全溶解后再补加 10ml 250mM KCl 溶液,滴加 5M NaOH(约 0.2ml)调 pH 至 7.0。加入去离子水将培养基定容至 1L。121℃灭菌 20 分钟。使用时加入5ml 灭菌的 2M MgCl2溶液(此种培养基称为 SOB)。再补加经 0.22μm 过滤除菌的 1M 葡萄糖溶液2ml(此种培养基为 SOC)。3、转化复苏细菌用的液体 LB 培养基或 SOC 培养基:可以一次高压 50ml 液体培养基,无菌状态按 1ml 每管分装于高压灭菌的 1.5ml 离心管中,装于自封袋中,冻存于-20℃中,每次用一支。可以极大地避免培养基污染和减少劳动量。 4、LB 固体选择培养基:100ml LB 液体培养基中加入 1.5g 琼脂粉,摇匀后,121℃高压灭菌 20 分钟。 冷却至 50℃左右时加入相应浓度的抗生素(如 AMP 浓度通常为100μg/ml),混匀后倒在细菌用的无菌培养皿中,等琼脂凝固后即可使用。5、IPTG:称量 1.9g IPTG(MW=238.31)充分溶解于 40ml 灭菌水,浓度为200mmol/L。用无菌0.22μm 过滤膜过滤除菌。小份分装后,-20℃保存。6、 X-gal:用 DMF(二甲基甲酰胺)配制成 20mg/ml,小份分装(1ml/份)后,-20℃避光保存。

储存/保存方法: -70℃保存,避免反复冻融

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