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产品描述:

产品名称:Shuffle T7-K12 感受态细胞

描述: Shuffle T7-K12菌株来源于大肠杆菌K12菌株,适用于T7启动子启动的蛋白表达。细胞内组成型表达的二硫键异构酶DsbC不仅有利于表达蛋白形成正确的二硫键,并具有分子伴侣的功能,帮助不含二硫键的蛋白正确折叠。T7 RNA聚合酶基因整合在细菌染色体上的lac操纵子区域,组成型表达的lac阻遏蛋白能降低基因的背景表达,有利于毒性蛋白的表达,没有λ前噬菌体序列,具有抗T1噬菌体感染特点。Shuffle T7-K12感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率大于10⁶ cfu/μg。
基因型:
F′ lac, pro, lacIq /△(ara-leu)7697 araD139 fhuA2 lacZ::T7 gene1△(phoA) PvuII phoR ahpC* galE (or U) galK λatt::pNEB3-r1-cDsbC (SpecR, lacIq)△trxB rpsL150(StrR)△gor△(malF)3
菌株抗性:
对氨苄青霉素,氯霉素,卡那霉素和四环素敏感,对链霉素和壮观霉素有抗性。

使用方法: 质粒转化步骤:1、将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后,加入质粒 DNA 到细胞中,用手指拨打管底,轻轻混匀;2、冰水浴中放置 30 分钟,不要晃动;3、42℃热击 60 秒钟,不要晃动;4、冰水浴中放置 2 分钟,不要晃动;5、加入 500μl 无菌的 SOC 或 LB 培养基;6、置于 30℃摇床中,150-200rpm,复苏培养 60 分钟;7、取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性的 LB 平板上。待液体吸干后,倒置平板 30℃培养 12-24 小时。平板划线分离法:复苏培养结束后,12000rpm 离心 30 秒钟,弃掉上清,留 100μl 左右的液体,用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块,取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上,倾斜吸头,用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更多更大的单克隆菌落。质粒快速转化步骤:将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟,对于氨苄青霉素抗性的质粒,步骤 4 完成后,可直接涂布或划线于含抗生素的平板上。其它抗性的质粒仍需 40-60 分钟的复苏培养。蛋白表达步骤:1、挑取单菌落,接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中;2、30℃,200rpm 震荡培养细菌至对数生长期(OD600=0.4-0.8);3、加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM,30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜;4、诱导完成后,离心收集菌体,用合适的方法(如考马斯亮蓝染胶法,Western-Blot法或酶活性分析法) 分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分,明确表达产物的表达状况(可溶性或不溶性表达);5、重组蛋白大量表达时,可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中,当培养到 OD600=0.4-0.8 时,加入终 浓度为 0.4mM 的 IPTG,30℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜(不同蛋白表达的最佳条件有所不同,需在实验中优化)。

储存/保存方法: -70℃保存,避免反复冻融

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