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产品描述:

产品名称:Rosetta-gami 2(DE3) 感受态细胞

描述: Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞是一种用于原核表达的菌株,具有Rosetta 2和Origami2两种菌株的优点。菌株中含有氯霉素抗性质粒pRARE2,可以提供大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)对应的tRNA,提高含稀有密码子的真核基因在原核系统中的表达。同时该菌株能够表达突变型硫氧还蛋白还原酶(TrxB)和谷胱甘肽还原酶(Gor),帮助含二硫键的外源蛋白在细胞内的正确折叠和稳定,增强蛋白的可溶性。该菌株的基因组中含有λ噬菌体的DE3区,可以表达T7 RNA聚合酶,适用于含T7启动子的pET表达质粒。Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达10⁷cfu/μg DNA。
基因型:
Δ(ara-leu )7697 ΔlacX74 ΔphoA Pvu II phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F'[lac+ lacIq pro] gor522::Tn 10 trxB pRARE2(CamR , StrR , TetR )
菌株抗性:
对氨苄青霉素,卡那霉素敏感。对氯霉素,四环素和链霉素有抗性。

使用方法: 质粒转化步骤:(以氨苄青霉素抗性的 pET 载体为例)1、将感受态细胞置于冰水浴中化冻。待细胞刚化冻后,加入 1-5μl 含有 1-100ng 的质粒 DNA 到细胞中,用手指拨打管底,轻轻混匀。2、冰水浴中放置 30 分钟,不要晃动。3、42℃热击 60 秒钟,不要晃动。 4、冰水浴中放置 2 分钟,不要晃动。 5、加入 500μl 的室温的 SOC 或 LB 培养基。6、置于 37℃摇床中,150-200rpm,复苏培养 60 分钟。7、取 50-100μl 菌液涂布在含有抗性(50μg/ml 卡那霉素,34μg/ml 氯霉素,10μg/ml 四环素和 50μg/ml 链霉素)的 LB 平板上。待液体吸干后,倒置平板 37℃培养 12-24 小时。平板划线分离法:复苏培养结束后,12000rpm 离心 30 秒钟,弃掉上清,留 100μl 左右的液体,用 200μl 吸头轻轻吹打散菌块,取 10μl 重悬的菌液分多点滴在平板上,倾斜吸头,用吸头头部的侧面将滴在平板上的液体来回划线。这个方法可以获得更大的单克隆菌落。蛋白表达步骤:1、挑取单菌落,接种到含 5ml 带抗生素的 LB 培养基中。 2、 37℃,200rpm 震荡培养细菌至对数生长期(OD600=0.4-0.8)。 3、加入 IPTG 到终浓度为 0.4mM,37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜。4、诱导完成后,离心收集菌体,用合适的方法(如考马斯亮蓝染胶法,Western-Blot法或酶活性分析法)分析菌体裂解物的总蛋白、上清和沉淀组分,明确表达产物的表达状况(可溶性或不溶性表达)。重组蛋白大量表达时,可用 10ml 过夜培养物转接到 1L 培养基中,当培养到 OD600=0.4-0.8 时,加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG, 37℃诱导 4 小时或 16℃诱导过夜(不同蛋白表达的最佳条件有所不同,需在实验中优化)。

储存/保存方法: -70℃保存,避免反复冻融。不适合在液氮中保存。

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