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产品描述:

产品名称:无内毒素高纯度质粒大量快速提取试剂盒

描述: 本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,粗提物通过过滤柱除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1、不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。从100~200ml大肠杆菌LB培养液中,可快速提取0.2~1.5mg纯净的高拷贝质粒,提取率达80~90%。
推荐每次菌液使用量:高拷贝质粒推荐使用量为100 ml,得率一般在500-1500 μg左右;低拷贝质粒推荐使用量为200 ml,得率一般在200-600 μg左右。
2、获得的质粒产量高,超螺旋比例高,纯度好,可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、转染等各种分子生物学实验。
产品信息:

使用方法: 使用前请先在漂洗液 WB 中加入无水乙醇。1、柱平衡步骤:向吸附柱 CP6 中(吸附柱放入 50ml 收集管中)加入 2.5 ml 的平衡液 BL,8,000 rpm (~8,228×g)离心 2 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收 集管中。(用平衡液处理过的柱子最好立即使用)。2、取 100ml(根据培养菌体的浓度选择合适的量,低拷贝推荐用 200 ml)过夜培养的菌 液加入离心管,室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心 3 min 收集细菌,尽量吸除上清。注意:菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中, 菌液量以能够 充分 裂解为佳,菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。3、尽量吸除上清,为确保上清液全部吸取,请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。4、向留有菌体沉淀的离心管中加入 8 ml 溶液 P1(请先检查是否已加入 RNase A),使 用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:请务必彻底悬浮细菌沉淀,如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解效果,导致 提取量和纯度偏低。对于低拷贝质粒,加大菌体用量的同时按比例增加 P1、P2 和 P4 的用量。 5、向离心管中加入 8ml 溶液 P2,立即温和地上下翻转 6-8 次,使菌体充分裂解,室温 放置 5 min。 注意:温和地混匀,不要剧烈震荡,以免污染基因组 DNA。此时菌液应变得清亮粘稠, 如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解不彻底,应减少菌体量。6、向离心管中加入 8 ml 溶液 P4,立即温和地上下翻转 6-8 次,充分混匀,至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置 10 min 左右。8,000 rpm (~8,228×g)离心 5-10 min, 使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间),将全部溶液小心倒入过滤器 CS1中 (请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器),慢慢推动推柄过滤,滤液收集在干净的 50 ml 的管中(自备)。注意:加入溶液 P4 后应立即混匀,避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器 CS1 中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多(>100 ml),推荐延长离心时间 至 20-30 min。7、向滤液中加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染),上下 颠倒 混匀后转移到吸附柱 CP6 中(吸附柱放入 50 ml 收集管中)。 注意:过滤后滤液会损失,根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇。吸附柱 CP6 的 最大容积为 15 ml,所以需要分两次过柱。个别情况下离心机转子倾角较大,此时,建 议加入吸附柱 CP6 的溶液体积不超过 10 ml,以防产生漏液现象。8、室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心 2 min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CP6 重新放回 收集管中。注意:将第 7 步中所得溶液分两次过柱,每次均按以上条件操作。9、向吸附柱 CP6 中加入 10 ml 漂洗液 WB (请先检查是否已加入无水乙醇),8,000 rpm (~8,228×g)离心 2 min,弃掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。10、重复操作步骤 9。11、向吸附柱 CP6 中加入 3 ml 无水乙醇,室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心 2 min,倒掉废液。12、将吸附柱 CP6 重新放回收集管中,8,000 rpm (~8,228×g)离心 5 min,目的是将吸附 柱中残余的漂洗液去除。 注意:漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR 等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响,建议将吸附柱 CP6 开盖,置于室温放置数分钟,以彻 底晾干吸附材料中残余的漂洗液。13、将吸附柱CP6置于一个干净的50 ml收集管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2 ml 洗脱缓冲液 EB,室温放置 5 min,然后室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心 2 min。将 50 ml 离心管中的洗脱液全部移入一个干净的 1.5 ml 离心管,-20℃保存。注意:为了增加质粒的回收效率,可将得到的溶液重新加入到吸附柱中,重复步骤 13。 洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用 ddH2O 做洗脱液应保证其 pH 值在 7.5-8.0 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质 粒的拷贝数 以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于 1 ml,体积过小影响回收效率。 DNA 产物应保存在-20℃,以防 DNA 降解。可选步骤(如果需要更高浓度的质粒,可进行如下操作):14、每 1 ml 洗脱液加入 1.42 ml 异丙醇以及 0.42 ml 5M NaCl (客户自备),混匀, 室温放 置 5 min,8,000 rpm (~8,228×g)离心 10 min,小心弃上清。15、加入 0.5 ml 的 70%乙醇洗涤沉淀, 室温 8,000 rpm (~8,228×g)离心 5 min,小心弃乙醇。 16、重复操作步骤 15。17、空气中干燥 DNA 沉淀 5-10 min, 根据需要用适当体积的 EB 缓冲液溶解沉淀。

储存/保存方法: 参考试剂盒说明书,有效期18个月。

注意事项: 1、溶液 P1 在使用前先加入 RNase A(将试剂盒中提供的 RNase A 全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。
2、使用前先检查平衡液 BL、溶液 P2 和 P4 是否出现结晶或者沉淀,如有结晶或者沉 淀现象,可在 37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。
3、注意不要直接接触溶液 P2 和 P4,使用后应立即盖紧盖子。
4、使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出,避免滤膜因压力而松动。
5、提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质 粒或大于 10 kb 的大质粒,应加大菌体使用量,同时按比例增加 P1、P2、P4 的用量;洗脱缓冲液推荐在 65-70℃水浴中预热。可以适当延长吸附和洗脱时间,以提高提取效率。
6、实验前使用平衡液 BL 处理吸附柱,可以最大限度激活硅基质膜,提高得率。
7、用平衡液处理过的柱子最好立即使用,放置时间过长会影响使用效果

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