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产品描述:

产品名称:2 × 预混实时荧光定量快速PCR反应体系

描述: 本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行实时荧光定量 PCR 的专用 2×浓度预混液。本产品含有优化浓度的HotStart Taq DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等成分。主要用于基因组 DNA 靶 序列和 RNA 反转录后 cDNA 靶序列的检测。HotStart Taq DNA Polymerase 高温加热前,抗 Taq单克隆抗体与 Taq 结合,抑制 Taq 的聚合酶活性,从而抑制在低温条件下出现的由引物和模板 DNA 非特异性杂交或引物二聚体引起的非特 异性扩增。抗体在 PCR 反应的预变性步骤中已完全失活,不会阻碍之后 Taq 酶聚合反应,大大提高了 PCR 反应的灵敏度及特 异性。 优化浓度的 SYBR Green I 荧光染料掺入 DNA 双链后,荧光信号增强,而不掺入链中 SYBR Green I 染料分子荧光信号不 变,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步,荧光可以在退火或延伸阶段测定。
本产品为 2×浓度预混实时荧光定量快速 PCR 反应体系,使用时只需加入模板、引物、ROX Reference Dye(用以校正孔与 孔之间产生的荧光信号误差,根据不同荧光定量 PCR 仪选择使用)和水,使其工作浓度为 1×,即可进行反应。具有快速简便、 灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点,可最大限度地减少人为误差、节约 PCR 实验操作时间、降低污染机率。

使用方法: 用户需自备的试剂:cDNA 或 DNA 模板、引物。
请按照不同品牌荧光定量PCR仪的使用说明书要求进行实验操作。
操作示例:分别以20 μ l和50 μ l PCR反应体系为例:
1.  PCR 反应体系的建立:

*模板量: 10-100 ng基因组DNA,或 1-10 ng cDNA 为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定最佳的模板使用量。 另外, Two Step RT-PCR 反应的cDNA( RT 反应液)作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的10% 。
*引物:通常引物浓度以 0.2 μM 可以得到较好结果,可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可,由此优化反应体系。为了获得理想的 qPCR 的效果,扩增片段的长度建议为 80-200 bp 。
*不同仪器所需 ROX Reference Dye不同,或需要添加或不需要添加,请根据仪器说明进行操作。
2。PCR 反应条件的设置: 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗体封闭的HotStart DNA聚合酶,如果在PCR反应 前进行模板的预变性,通常设定为95℃、2 min,复杂或高GC模板适当延长时间至5 min。该DNA聚合酶在15 s内可完成至 少300 bp的扩增,可以满足绝大多数的qPCR实验;对于超过350 bp或者高GC含量的扩增子,建议增加延伸时间至60 s或者 采用三步法以提高扩增效率。

注 : 以上举例为常规 qPCR
反应系统,仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异 , 需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件,并根据比例放大或缩小反应体系。
3. 在相应的 real time PCR 仪器上完成实验,并分析结果。

储存/保存方法: -20℃避光保存,保质期 24 个月,避免反复冻融。如果经常使用,可置于 4℃保存至少 3 个月。

注意事项: 1. 使用前请上下颠倒轻轻混匀,尽量避免起泡,并经短暂离心后使用。 2. 尽可能减少 RealStar Green Fast Mixture 在光下的曝露时间,长时间的曝光可导致荧光信号减弱。 3. 反应液的配制、分装请一定使用无污染的枪头、Microtube 等,尽量避免交叉污染。 4. 本品不能用于杂交探针法。

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