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产品描述:

产品名称:Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)

描述:

第一链cDNA合成预混液是以mRNA或者总RNA为模板,高效合成第一链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂(Reverse Transcriptase,RNase Inhibitor,Oligo(dT)18,Random N6,dNTPs)。反应时只需要加入RNA模板和水即可,操作简单,降低操作过程中的污染。本制品含有去基因组成分gDNA Purge,以RNA为模板进行cDNA第一链合成时,可以同步去除基因组DNA污染,反应结束后,75℃加热5分钟,就可以失活反转录酶,RNA酶抑制剂,gDNA Purge。合成的第一链cDNA能直接用于PCR或荧光定量PCR的模板,第二链cDNA的合成或线性RNA扩增,也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。

产品特点:

本制品采用耐高温逆转录酶,大幅度提高了热稳定性和cDNA合成效率。

本制品中添加的NovoScript Reverse Transcriptase无RNase H活性,可避免第一链cDNA合成过程中,RNA/DNA杂交模板链中RNA降解,保证cDNA合成的质量。

本制品中Random N6和Oligo(dT)18引物比例经过优化,可均匀合成样品中的cDNA。

本制品中含有去基因组成分,进一步提高定量准确性。
产品组分:

实验方法:

第一链 cDNA 合成:

试剂融化后,各组分混匀稍微离心后置于冰上。

(1)去基因组 DNA 反应

42℃孵育 5min,反应结束后冰上放置。

(2)逆转录反应

注:若 cDNA 后续用于 qPCR,逆转录时间:50℃孵育 15min;若 cDNA 后续用于普通 PCR,逆转录时间:50℃,孵育 30min。

(3)75℃孵育 5min,终止反应。反应产物可直接用于 PCR,如果不立即使用,-20°C保存,长时间保存建议-70°C放置。

注:当 RNA 浓度较高或目标基因属高拷贝基因时,可将去基因组和逆转录合为一步操作,更省时省力。所有组分加到一起,50℃孵育 15-30min,最后 75℃孵育 5min 终止反应即可。

第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

常用反应体系(50ul):

*Mg²⁺终浓度为2mM

常用 PCR 循环:

储存/保存方法: -20℃

注意事项: 1、用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子要确保扣严。
4、纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
5、为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。
6、有实验结果提示,本反转录酶可在20分钟内完成11kb反转录反应。

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