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产品描述:

产品名称:Reverse Transcriptase

描述: 本制品是通过基因重组技术克隆表达M-MuLV的缺失突变型RNase H-的反转录酶。一般的野生型M-MuLV(Moloney Murine Leukemia Virus)具有以下几种活性:依赖于RNA的DNA聚合酶活性;依赖于DNA的DNA聚合酶活性;RNase H活性。由于RNaseH能够催化降解 DNA/RNA杂合体中的RNA,因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失,延伸能力强,可用于较长的cDNA合成,高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。
产品组分:

实验方法:
cDNA 第一链合成反应体系:
试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
1) 按顺序加入以下反应物

2)  如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构,可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后,65°C 孵育5分钟,冰上冷却,再加入其它组分。

3)  轻轻混匀,离心。42°C 孵育15-30分钟。如果RNA模板中不含poly A结构,25°C 先孵育5分钟,随后42°C 孵育15-30分钟。反应产物可直接用于 PCR,如果不立即使用, -20°C 保存少于一周,长时间保存建议-70°C放置。

注:有实验结果提示,本反转录酶可在 15 分钟内完成 1kb 反转录反应。

第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

        合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

常用反应体系(50μl)

*Mg2+终浓度为 2mM

常用 PCR 循环:

储存/保存方法: -20℃,有效期6个月。

技术指标:

质量保证:经多次柱纯化,SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带,PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留,无核酸内、外切酶污染,无 RNA 酶污染。

活性定义:以Poly(rA)?Oligo(dT)为模板/引物,在37℃、10分钟条件下, 掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。

产品用途: 1、1st Strand cDNA的合成;2、cDNA Probe的制备;3、RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。

注意事项: 1、用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子确保扣严。
4、纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
5、为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。

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