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产品描述:

产品名称:Reverse Transcriptase II

描述: Reverse Transcriptase II 是对M-MuLV(RNase H-)进行基因工程改造,表达并纯化的高温逆转录酶,比M-MuLV(RNase H-)提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下(50~60℃)进行cDNA第一链的合成,高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃,具有热稳定相强,灵敏度高,特异性高,聚合能力强等优点。
产品组分:

实验方法:

cDNA 第一链合成反应体系:

试剂融化后,将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

(1) 按顺序加入以下反应物

(2)可选优化步骤:如果RNA模板GC含量高或含有二级结构,可先将模板与引物的混合液轻轻混匀,短暂离心,65°C 孵育5min,冰上冷却。

(3)轻轻混匀,离心。

(4)如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物,50°C 孵育15-30min。 使用随机六聚体引物时,25°C,先孵育5min,随后50 °C 孵育15-30min。对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板,使用60℃孵育 15-30min。

(5)70°C 加热5min终止反应。反应产物可直接用于 PCR 反应,如果不立即使用,-20°C 保存少于一周的时间。长时间保存建议-70°C 放置。

第一链 cDNA 的 PCR 扩增:

合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

常用反应体系(50μl)

*Mg2+终浓度为 2mM

常用 PCR 循环

使用方法: 使用建议: 1、用DEPC处理实验用到的所有实验器材,或者购买已经证明无核酸酶的实验用具,实验过程戴手套并经常更换手套,避免RNA酶的污染。 2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。 3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中,所有管子确保扣严。 4、纯化过的RNA必须保证不含有盐,金属离子,乙醇和苯酚,以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。 5、可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。 6、为保证反转录反应的有效进行,需使用高质量的RNA模板。 7、最快可达2kb/min,需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当延长反转录时间。

储存/保存方法: -20℃

技术指标:

质量保证:

经多次柱纯化,SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带。PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留,无核酸内、外切酶污染,无 RNA 酶污染。

活性定义:

以 Poly(rA)?Oligo(dT)为模板/引物,在 50℃、10 分钟条件下,掺入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位。

产品用途: 1、1st Strand cDNA的合成; 2、cDNA Probe的制备;3、RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。

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