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产品描述:

产品名称:酵母基因组DNA快速提取试剂盒

描述: 该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统,适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。酵母细胞经lyticase处理去除细胞壁后,独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。纯化的DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。 
菌体浓度检测:可采用分光光度计或平板培养法检测菌体量,一般对于酿酒酵母,OD600值为1.0时,相当于1-2×10⁷ cells/ml。 
产品特点:
1、重复性好:离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小。克服了膜质量不稳定的弊端。
2、提取纯度高,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。 3、简单快捷,操作安全。
自备试剂:无水乙醇、Sorbitol buffer、β-巯基乙醇
产品信息:

使用方法: 提示: 1、第一次使用前请先在 15ml 漂洗液 WB 中加入 60ml 无水乙醇,充分混匀,加入后 请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入! 2、吸取使用量的 Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇,回复到室温备用。 操作: 1、取酵母培养物(不超过 5×10 7 cells),12,000rpm 离心 30 sec,尽可能的吸弃上清,收集 菌体。 2、酵母细胞壁的破除: 酶法:向菌体中加入 600μl 山梨醇 buffer,加入大约 50 U Lyticase 充分混匀。30℃处理 30 min,4000rpm(~1500×g)离心 10 min,弃上清,收集沉淀。 注意:以上为 5×10 7 个酵母细胞的 Lyticase 用量,根据酵母的菌株和酵母细胞数量的 不同,所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。如果破壁效果不好导致DNA 产量低,可以加大 lyicase 用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间来提高效果,不适合 Lyticase 消化的酵母可选用 Zymolase 或者其它方法如玻璃珠涡旋,煮沸,反复冻融等 破碎细胞。 3、向沉淀中加入 180μl 缓冲液 YB 充分重悬细胞团。 如果需要去除 RNA,可加 4μl RNase A(10 mg/ml)溶液(RNA 酶客户自备),振荡 15 sec,室温放置 5 min。 4、加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml),立刻涡旋振荡充分混匀。 5、加入 220μl 结合液 CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置 10 min。 注意:加入缓冲液 GB 时可能会产生白色沉淀,一般 70℃放置时会消失,不会影响后续 实验。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,可能导致提取 DNA 量少和提取的 DNA 不纯。 6、加 220μl 无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管 盖内壁的水珠。 7、将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱 AC 中,(吸附柱放入收集管 中)12,000rpm 离心 30-60 sec,倒掉收集管中的废液。 8、加入 500μl 抑制物去除液 IR,12,000rpm 离心 30 sec,弃废液。 9、加入 500μl 漂洗液 WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心 30 sec, 弃掉废液。 10、重复操作步骤 9。 11、将吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 离心 2 min,将吸附柱置于室温放置数分 钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 12、取出吸附柱 AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加 50-200μl 洗脱 缓冲液 EB(洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置 2-5 min, 12,000rpm 离心 1 min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置 2 min, 12,000rpm 离心 1 min。(注意:DNA 产物应保存在-20℃,以防 DNA 降解)

储存/保存方法: 室温保存,有效期12个月。

注意事项: 1、结合液 CB 或者抑制物去除液 IR 低温时可能出现析出和沉淀,可以在 37℃水浴几分 钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2、结合液 CB 和抑制物去除液 IR 中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾 染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3、为避免降低活性,方便运输,提供 Lyticase(2500U)为冻干粉状,收到后,可短暂离 心后,加入 0.25 毫升灭菌水溶解配制成 10U/μl,反复冻融可能会降低酶活性,可酌 情分装-20℃保存。
4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化。
5、Sorbitol buffer( 1M 山梨醇, 0.1M Na2EDTA,14 mMβ-巯基乙醇)。配制方法:称取 182.2g 山梨醇溶于 600ml 去离子水中,加入 200ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ,定容 至 1L,溶液 4℃保存。临用前加入β-巯基乙醇至 0.1% 浓度(商品化的β-巯基乙醇摩 尔浓度一般为 14M)。
6、洗脱液 EB 不含有螯合剂 EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱, 但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。 DNA 如果需要长期保存,可以用 TE 缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0),但是 EDTA 可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

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