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产品描述:

产品名称:Random Mutagenesis Kit

描述:     随机突变是阐述蛋白质结构和功能之间的关系、改进蛋白质性能的重要工具。StarMut随机突变试剂盒基于易错PCR (error-prone PCR) 技术,利用Taq DNA polymerase不具有3′→5′校对功能的特性,在特定的反应缓冲体系中,向扩增的目的基因中引入随机突变密码子。带有随机突变的扩增产物通过双酶切,连接到表达载体中构建文库,然后转化入表达宿主中,进行蛋白活性筛选。如果经一次突变反应不能获得满意的结果,可采用连续易错PCR (sequential error-prone PCR)策略,即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的突变累积而产生更有意义的突变。
     本公司生产的 Random Mutagenesis Kit包含有优化的2 x  Random System、 Enhancer和ddH₂O三种组分,操作简便快速,使用时只需加入DNA模板和合成的带有双酶切位点的两条引物,并用水补足体积,即可进行扩增。2 x Random System含有优化浓度的Taq DNA polymerase、 dNTPs、 Mg²⁺和buffer,可最大限度地克服其他试剂盒以G和C突变为主的缺点,大大减少突变碱基的偏爱性和终止密码子的引入,获得相对均衡的突变谱。Mut Enhancer用于增加扩增突变率。
产品特点:
1、操作简便:采用优化的预混体系,减少多次加样可能造成的出错机会和污染机会 。
2、错配率可灵活掌握。
产品信息:

储存/保存方法: -20℃恒温保存,保质期12个月。

产品用途: 6 kb以下质粒的多个非邻近位点的碱基置换( substitution)、缺失( deletion)、或插入( insertion)

注意事项: 1、由于不同 DNA 模板的碱基组成不同、长度不一,以及不同引物的扩增效率存在差异,所以即使在相同的 PCR 反应条件下,两组 PCR 产物所得到的突变率也可能不同。因此我们建议根据具体实验要求,首先进行多个小体系(20 μl)扩增预实验,分别加入不同体积的 StarMut Enhancer(如 0 μl、1 μl、5 μl、10 μl 等),通过测序或活性检测等方法,摸索出符合目标突变率的反应条件后,再放大扩增体系。
2、起始 DNA 模板的浓度对突变率有很大影响,通常可通过提高或降低 DNA 模板的浓度来调整突变率。鉴于不同型号的分光光 度计检测的 DNA 浓度存在偏差,DNA 模板最好在酶切线性化后,采用凝胶电泳方法,与已知浓度的线性化双链 DNA 或商品化的 DNA marker 进行对比,确定其浓度。
3、突变反应产物必须进行切胶回收处理,去除 DNA 模板、PCR 产物上结合的 Taq 酶以及其他杂质。常规的乙醇沉淀、硅胶膜 (珠)或玻璃奶吸附等方法,均无法去除结合的 Taq 酶,后者可能遮蔽酶切位点,影响克隆效率。
4、建立随机突变文库通常需要 10-200 ng/μl (相当于 500 ng -10 μg/50 μl 体系)的 PCR 产物。如遇产量不足,可通过下列方法提高产量:
(1)突变率符合需求时,可放大 PCR 体系,或切胶回收 PCR 产物后,采用常规 PCR 反应条件进行扩增;
(2)突变率低于需求时,提高 PCR 扩增循环数,或切胶回收 PCR 产物后,进行第二轮随机突变反应;
(3)重新设计扩增引物;
(4)降低退火温度;
(5)确保模板质量,采用凝胶电泳方法精确定量。
5、对于带有克隆酶切位点的 DNA 模板,必须在 PCR 反应结束后,使用 DpnI 完全消化清除甲基化的模板,再切胶回收目标 DNA 片段。对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌 JM110 或 SCS110 菌株中提取的质粒),可通过转化 dam+ 的大肠杆菌菌株(如 DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等),再抽提获得甲基化的质粒作为 PCR 反应模板。
6、经过双酶切的克隆载体在插入突变DNA片段前,应首先通过自身连接检测,确保极低的自连背景。必要时可采用去磷酸化、 切胶回收等方法把自连率降至最低,以免影响后续连接反应。

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