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产品描述:

产品名称:超纯总RNA快速提取试剂盒(含DNase I)

描述: 改进的异硫氰酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA 酶,然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将物、蛋白等杂质去除, 低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1、独特的吸附柱设计,消除了液体残留及污染,并且洗脱体积 可至5μl。
2、结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好,纯度高和离心柱方便快捷的优点,RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
3、 的RL裂解液配方,可以有效的消除基因组污染。
4、有效的去除了5S在总RNA中含量,提高了纯度。
产品信息:

使用方法: 1、匀浆处理: (1)组织 用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品,保存于液氮内样品需要用研钵磨碎,每50~100 mg组织加1 ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。 (2)单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入1 ml的RL溶解细胞,并用移液枪轻轻吹打混 匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的RL量(每10 cm2加1 ml)。 一般情况下,普通大小的细胞培养瓶,加入1 ml的RL,迅速轻摇使RL充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀。当RL用量不足时可导致抽提的RNA中有基因组DNA污染。 (3)悬浮生长的细胞 通过离心来沉淀细胞。在RL试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5~10×10 6 的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×10 7细菌加1 ml的RL。在加入RL前应避免洗 涤细胞,否则会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀 浆器。 2、将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15 -30°C条件下孵育5 min以使核蛋白体完全分解。 3、每1 ml RL加0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15 sec并将其在室温下孵育3 min。 4、于4℃12,000 rpm 离心10 min,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的 水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%,把水相转移到 新管中,进行下一步操作。 5、加入1倍体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),颠倒混匀(此时可能会出 现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。 6、12,000 rpm 离心45 sec,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。 7、加400 μl去蛋白液RE,12,000 rpm 离心45 sec,弃掉废液。 8、DNase I工作液的配制:取10 μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中,加入 70 μl RDD溶液,轻柔混匀。 9、向吸附柱RA中央加入80 μl DNase I工作液,室温放置15 min(一般情况下室温放置可得到较好的消化效果,如果室温效果不佳可选择在37℃放置15 min)。 10、加400 μl去蛋白液RE,12,000 rpm 离心45 sec,弃掉废液。 11、加入500 μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心45 sec, 弃掉废液。 12、加入500 μl漂洗液RW,12,000 rpm 离心45 sec,弃掉废液。 13、将吸附柱RA放回空收集管中,12,000 rpm离心2 min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 14、取出吸附柱 RA,放入一个 RNase free 离心管中,根据预期 RNA 产量往吸附膜的中间部位加 50-80 μl RNase free H2O(事先在 65℃水浴中加热效果更好),室温放置 2 min, 12,000 rpm 离心 1 min。如果需要较多 RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心 1 min。

储存/保存方法: 参考试剂盒说明书,有效期12个月。

注意事项: 1、所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度过低,溶液可能会形成沉淀,此时不应该直接使用,可在 37℃水浴加热,直至溶液恢复澄清。
2、不合适的低温(4℃或者-20℃)储存会造成溶液沉淀,影响使用效果。裂解液 RL 可 以常温运输,收到后 4℃避光保存。
3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
4、 次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
5、为防止RNA降解,所有离心步骤如未加说明,均在4℃低温进行。使用转速可以达到 12,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
6、裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
7、考虑到环保问题,本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿,用户使用前需要自备氯仿。
8、常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在 电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带,分别为~5Kb(28S),~2Kb(18S), 条带亮度比值约为2:1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S,tRNA)带。但有时候 根据不同的物种如某些植物组织可以看到4,5条带也属于正常现象,如果RNA未成 熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的 不连续的高分子量条带。
9、检测OD260/OD280吸光度比值时,RNA样品应该溶于TE后检测,如果用水稀释后检测, 由于一般水离子强度和PH值低,会使OD280升高,从而使比值降低。
10、加入裂解液RL匀浆后,加氯仿前,样品可在 -70℃至-80℃保存一个月。

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