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产品描述:

产品名称:全血RNA快速提取试剂盒(Dnase I)

描述: 红细胞裂解液选择性裂解红细胞,然后独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解白细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将物,蛋白等杂质去除, 低盐的RNase free H20将RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1、重复性好,柱与柱之间吸附量差异极小。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2、操作安全,不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤.。
3、简便快捷,单个样品操作一般可在40分钟内完成。
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇
产品信息:

使用方法: 提示:1、使用前将 10×RLB(RNase-free)用 DEPC 处理水稀释到 1×。2、操作前在裂解液 RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度 1%,如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巯基乙醇。此裂解液 现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。操作:1、在适合大小的RNase free离心管中加入1体积(<1.5 ml)加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠 倒混匀后)和 3 体积的 1×RLB(RNase free),颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。2、室温放置 10 min(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞)。 如果 RNA 降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。3、12,000 rpm 离心 20 sec,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团。如发现红细胞大量残留可重复 2,3 步骤。4、涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加 350 μl(<2×10 6白 细胞)或者 600 μl(0.5-1.5 ml 全血或 2×10 6-1×10 7 白细胞)裂解液 RLT,吹打混匀 后用手剧烈振荡 20 sec,充分裂解。5、用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满 意匀浆结果(或者电动匀浆 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高产量。6、较 估计裂解物体积,加入等体积的 70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!), 此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 7、将混合物(每次小于 700 μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中(吸附柱放入 收集管中),12,000 rpm 离心 30-60 sec,弃掉废液。8、加 350 μl 去蛋白液 RW1,室温放置 30 sec,12,000 rpm 离心 30 sec,弃掉废液。将吸 附柱 RA 放回收集管中。9、.DNase I 工作液的配制:取 10 μl DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中,加入 70 μl RDD 溶液,轻柔混匀。10、向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液,室温放置 15 min(一般情况下室温放 置可得到较好的消化效果,如果室温效果不佳可选择在 37℃放置 15 min)。11、加 350 μl 去蛋白液 RW1,室温放置 30 sec,12,000 rpm 离心 30 sec,弃掉废液。将 吸附柱 RA 放回收集管中。12、加入 500 μl 漂洗液 RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 30 sec, 弃掉废液。加入 500 μl 漂洗液 RW,重复一遍。13、将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 min,将吸附柱置于室温放置数分 钟,以 晾干吸附材料中残余的漂洗液。14、取出吸附柱 RA,放入一个 RNase free 离心管中,根据预期 RNA 产量在吸附膜的中 间部位加 30-50 μl RNase free H2O(事先可在 65℃水浴中加热效果更好),室温放置 1 min,12,000 rpm 离心 1 min。15、如果提取全血>0.5 ml 或者>2x10 6白细胞,加 30-50 μl RNase free H2O 重复步骤 14, 合并两次洗脱液,或者使用 次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍。

储存/保存方法: 参考试剂盒说明书,有效期12个月。

注意事项: 1、 次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2、需要自备一次性注射器。
3、裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮 肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4、关于DNA的微量残留: 由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留(一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见) 影响不是很大,如果要进行严格的 mRNA 表达量分析如荧光定量 PCR,我们建议在进 行模板和引物的选择时:
(1)选用跨内含子的引物,这样 DNA 就不能作为模板参与扩增反应。
(2)选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。
5、RNA 纯度及浓度检测:
完整性:RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件:胶浓度 1.2%;0.5×TBE 电泳缓冲 液;150V,15 min)检测完整性。由于细胞中 70%-80%的 RNA 为 rRNA,电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小分别约为 5 kb 和 2 kb,分别相当 于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍,否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA,OD260/OD280 读数(10 mMTris, pH7.5)在 1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的 pH 值 影响。同一个 RNA 样品,假定在 10 mM Tris,pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280 读数 1.8-2.1 之间,在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间,但这并不表示 RNA 不纯。
浓度:取一定量的 RNA 提取物,用 RNase-free 水稀释 n 倍,用 RNase-free 水将分光 光度计调零,取稀释液进行 OD260,OD280测定,按照以下公式进行 RNA 浓度的计算: 终浓度(ng/μl)= (OD260)×(稀释倍数 n)×40

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