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产品描述:

产品名称:组织/细胞RNA快速提取试剂盒(Dnase I)

描述: 独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将物,蛋白等杂质去除, 低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1、重复性好,离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小。
2、操作安全,不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3、简便快捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
自备试剂:β-巯基乙醇、无水乙醇(Dnase I)
产品信息:

使用方法: 提示: 1、 次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入量无水乙醇! 2、操作前在裂解液 RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度 1%,如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巯基乙醇。此裂解液 现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。 操作: 1.组织培养细胞 (1)收集<10 7悬浮细胞到一个 1.5 ml 离心管,对于贴壁细胞,孔板培养可以直接裂解, 细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。 (2)12,000 rpm 离心 10 sec(或者 300×g 离心 5 min),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清, 留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。 (3)轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬,加入 350 μl(<5×10 6 细胞)或者 600 μl (5×10 6-1×10 7细胞)裂解液 RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡 20 sec,充分裂解。 (4)用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到 满意匀浆结果(或者电动匀浆 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高产量。 (5)接操作步骤项下 3。 2、动物组织(例如鼠肝脑) (1)电动匀浆:新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入 350 μl(<20 mg 组织)或者 600 μl(20-30 mg 组织)的裂解液 RLT 后电动 匀浆 20-40 sec。 (2)液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(20 mg/30 mg)转入 装有 350 μl/600 μl 组织裂解液 RLT 的 1.5 ml 离心管中,用手剧烈振荡 20 sec,充 分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直 到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆 30 sec),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提 高产量。 (3)将匀浆后裂解物 12,000 rpm 离心 3 min,沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶 物,将裂解物上清小心转到一个新离心管。 (4)接操作步骤项下 3。 3、较 估计裂解物(上清)体积,加入等体积的 70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 4、立刻将混合物(每次小于 700 μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中(吸附 柱放入收集管中),12,000 rpm 离心 60 sec,弃掉废液。 5、加 350 μl 去蛋白液 RW1,室温放置 30 sec,12,000 rpm 离心 30 sec,弃掉废液。将吸 附柱 RA 放回收集管中。 6、DNase I 工作液的配制:取 10 μl DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中,加入 70 μl RDD 溶液,轻柔混匀。 7、向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液,室温放置 15 min(一般情况下室温放 置可得到较好的消化效果,如果室温效果不佳可选择在 37℃放置 15 min)。 8、加 350 μl 去蛋白液 RW1,室温放置 30 sec,12,000 rpm 离心 30 sec,弃掉废液。将 吸附柱 RA 放回收集管中。 9、加入 500 μl 漂洗液 RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 30 sec, 弃掉废液。加入 500 μl 漂洗液 RW,重复一遍。 10、将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 min,将吸附柱置于室温放置数分 钟,以 晾干吸附材料中残余的漂洗液。 11、取出吸附柱 RA,放入一个 RNase free 离心管中,根据预期 RNA 产量在吸附膜的中 间部位加 30-50 μl RNase free H2O(事先在 65℃水浴中加热效果更好),室温放置 1 min,12,000 rpm 离心 1 min。

储存/保存方法: 室温保存,有效期12个月。

注意事项: 1、需要自备一次性注射器,研钵。裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
2、关于DNA 的微量残留:一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留,本公司的RNA 提取产品,在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留(一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的 mRNA 表达量分析如荧光定量 PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
(1)选用跨内含子的引物,以穿过 mRNA 中的连接区,这样 DNA 就不能作为模板参与 扩增反应。
(2)选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

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