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产品描述:

产品名称:液体样本RNA抽提试剂

描述: 本试剂是直接从来源于人、动植物、酵母、细菌和病毒的液体样品中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来回收。
无论是人、动物、植物还是细菌组织,该方法对少量及大量的组织和细胞均有较好的分离效果。本试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。本产品抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR,当两条引物位于单一外显子内时,建议用扩增级的DNaseI来处理抽提的总RNA。
本产品能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠gan脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7kb和15kb之间不连续的高分子量条带,两条优势核糖体-5kb (28S)和-2kb(18S),低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。
自备试剂:氯仿、异丙醇、75%乙醇(用DEPC处理过的水配制) 、无RNA酶的水或0.5% SDS溶液调配无RNA酶的水——将水加入无RNA酶的玻璃瓶中,加入DEPC至0.1% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。SDS溶液必须用DEPC处理过并经高压灭菌的水配制。
重要提示:有毒物接触皮肤或者不慎吞服,会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适,看医生并寻求苯酚和其他成分的正确 方案。

使用方法: 1、样品预处理: (1)生物液体 每0.25ml液体样品(血清,血浆,脑脊液等等)加入0.75ml 本试剂,用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×10 6个细胞至少加入0.75ml 本试剂。对于含有高污染物样品如全血样品,可以用灭菌水按照1:1比例稀释一倍后开始提取。本试剂和液体样品的终体积比总是3:1。 (2)组织 用glass或强力匀浆器搅匀组织样品,每50~100mg组织或者0.25ml组织悬液加 0.75ml的试剂。一般50~100mg组织体积都要小于0.25ml,如果组织样品的体积小 于0.25ml,加入灭菌水将组织样品体积调整到0.25ml以保证体积比例是3:1。 (3)单层生长的细胞 直接往直径3.5 cm的培养板中加入0.3ml-0.4ml的试剂溶解细胞,用加样枪吹打帮助充分裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的试剂量(每10cm2加0.3-0.4ml)。不需要往裂解物里面加水,因为培养板中附着残留的培养液已经充分稀释了试剂。 (4)悬浮生长的细胞 通过离心来沉淀细胞。在试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每 5~10×10 6的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×10 7细菌加0.75ml的试剂。和步骤b 一样用灭菌水调节样品体积到0.25ml。在加入试剂前应避免洗涤细胞,因为那样 会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。 (5)病毒液处理 直接取病毒液,加入3倍体积本试剂,充分振荡混匀。 2、分离阶段 将匀浆样品在15-30°C条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解。每0.75ml本试剂加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在室温下孵育2~15 min。在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15 min。离心后混合物分成三层:下层苯酚-氯仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。 水样层的容量大约为所加本试剂容量的70%。 3、RNA 的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中,如果希望分离DNA和蛋白,有机层和中间层同 样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。每0.75ml 本试剂对应0.5ml 异丙醇。将混合的样品在15-30°C条件下孵育10min并在2~8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10 min。RNA沉淀在离心前通常不可见,离心后会形成一胶状片状 沉淀附着于试管壁和管底。 4、RNA 的漂洗 移去上层悬液。用75%的乙醇(RNase-Free water配制)洗涤RNA沉淀一次,每0.75ml 的TRzol LS至少加1ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C下以不超过7,500×g的 离心力高速冷冻离心5 min。 5、RNA 的再溶解 室温简单干燥 RNA 沉淀,不要在真空管里离心干燥 RNA。尤为重要的是,不能让 RNA 沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的 RNA 样品其OD260/OD280 比值 <1.6。用移液管分几次移取 RNase-Free water 或 0.5%SDS 溶液 (RNase-Free water配制)来溶解RNA(如果RNA以后要用于酶切反应时,避免使用SDS。) RNA 还能被 甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在-70°C。

储存/保存方法: 2-8℃保存,有效期12个月。

注意事项: 1、从少量的组织(1~10mg)或细胞(100-10000个)中分离 RNA 样品:往组织或细胞中加 入 800μl TRzol。待样品裂解后,加入氯仿并进行步骤 2 中的抽提操作。在用异丙醇沉 淀 RNA 之前,加入 5~10μg 无 RNA 酶的 glycogen 作为水样层的载体。为降低其黏度 在加入氯仿前用 26 号注射器抽吸两次以切断基因组 DNA。Glycogen 会留在水样层中并和 RNA 共析出。在浓缩到 4mg/ml 之前它不会抑制逆转录反应 链的合成也不会抑制 PCR。
2、在匀浆化后和加入氯仿之前,样品可以在-60℃或者-70℃保存至少一个月。将 RNA 沉淀溶于75%的乙醇在 2-8℃至少可以保存一周,在-5—-20℃下至少可保存一年。
3、用本试剂盒抽提 RNA 时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免吸入。如无例外,室温保持在 15~30℃的条件下。

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