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产品描述:

产品名称:快速多片段DNA组装预混液

描述:         基于重组原理的无缝克隆技术,作为新一代的克隆方法,不依赖繁琐的酶切、连接步骤,也不需要末端补平等操作,依据 DNA 片段与线性化载体末端的 15~25 nt 同源序列的重组,可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点,载体自连背景极低,是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术。
        LightNing DNA Assembly Mix Plus 无缝克隆试剂盒,一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组,最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组,且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子,有效提高克隆阳性率;经优化的反应体系,能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。
产品组成

浓度: 2 ×

使用方法: 实验步骤
1、实验流程概要

2、线性化克隆载体制备
选择合适的克隆位点,对载体进行线性化,载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。
① 酶切制备
推荐使用 LightNing 快速内切酶进行双酶切,使载体线性化完全,以降低转化背景 ( 假阳性克隆 );若使用单酶切进行线性化,可以适当延长酶切时间以减少环状质粒残留。
注 1:经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化,经单酶切则需要去磷酸化;
注 2:酶切完成后,应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
② 反向 PCR 扩增制备
为减少扩增突变的引入,推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板,以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。
3、插入片段 PCR 引物设计
PCR 引物的 5' 端必须包含与其相邻片段(插入片段或载体)末端同源的 15~25 nt(推荐 18 nt)序列。假如载体为粘性末端,且 3' 端突出,则引物设计必须包含突出部分;若 5' 端突出,则引物设计可以包含突出部分,也可以不包含。
插入片段正向扩增引物:
5'—上游载体末端同源序列 + 酶切位点(可选)+ 基因特异性正向扩增序列— 3'
插入片段反向扩增引物:
3'—基因特异性反向扩增序列 + 酶切位点(可选)+ 下游载体末端同源序列—5'
注 1:尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆,当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为 40%~60% 时,重组效率最高;

注 2:本试剂盒所提供的 pUC 19 载体(Ampr)连接端序列如下: 

4、插入片段的 PCR 扩增
推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增,以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应,若 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物,可直接使用,但加样体积不应超过总反应体积的 20%。

储存/保存方法: -20℃保存,有效期24个月。

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