一、所需仪器：
酶标仪（波长 450nm，10μL、100μL、1mL移液器，300μL多道移液器，移液器吸头、37℃恒温水浴箱。

二、操作步骤：
1、将浓缩洗涤液用蒸馏水做 10 倍稀释。
2、取出包被有抗 BSA 的 96孔酶标板在室温放置回温。标准品各浓度做平行两孔，50μL/孔加入酶标板中。加待检样品、内部参比，各两孔，50μL/孔。然后将酶标记抗体用酶标抗体稀释液做 1:100 稀释，加入各反应孔，100μL/孔（酶标记抗体用多少稀释多少，现用现配）。加样过程须在 15 分钟内完成。
3、置室温 20~24℃避光反应 1 小时，用洗涤液洗涤四遍，拍干。
4、用移液器加 TMB 底物显色液 100μL/孔，请勿震荡，室温 20~24℃避光反应 10 分钟。
5、用移液器加终止液 100μL/孔，稍微震荡 5s 混匀。
6、在酶标仪 450nm 波长处读数。

3、判定：
在标准曲线中，设 OD0~16ng/mL 为区间 A；OD16~32ng/mL 为区间 B；大于 OD32 ng/mL 为区间 C。
（1）如测得的 OD 值小于标准曲线中 2ng/mL 对应 OD 值，则 BSA 含量测定结果计为小于 2ng/mL。
（2）如不同稀释浓度的样本测得的 OD 值均位于区间 A，则最终结果计算取其min稀释度的测定值。
（3）如不同稀释度的测定值均位于区间 B 或同时位于区间 A 和 B 或同时位于区间 B 和 C，则取其最接近OD16ng/mL 的测定值。
（4）如不同稀释度测定值均位于区间 C，则需将样本做进一步稀释测定，使其测定值居 2~32ng/mL 所对应的 OD 值区间，计算方法按上述 7.3.2-4。
（5）如高稀释度测得OD 高于低稀释度或未稀释的样本OD，则可能是操作失误或样本中BSA 含量过高（HOOK效应），需重试或调整稀释度。
（6）最终结果要考虑稀释因素（实际 BSA 含量＝计算值 X 稀释倍数）。

四、本试剂盒技术指标
1、检测限和定量限
检测限：零浓度标准品加上两倍的标准差（20 个零孔计算值），本试剂盒检测限计算为 0.2ng/mL(ppb)。定量限为标准曲线检测下限，1 ng/mL。
2、准确度和精密度
计算批内批间变异系数，在高中低三个浓度（20、10、5）下五个重复检测计算批内变异系数，不同时间重复三次计算批间变异系数，CV%均小于 10%。
3、交叉反应

浓度(ng/ml)	SD	回收率%	CV%	浓度(ng/ml)	SD	回收率%	CV%
20	0.06	107.3	5.6	20	0.047	102.6	4.6
10	0.049	105.4	4.7	10	0.022	101.2	2.2
5	0.059	99.66	5.9	5	0.028	97.6	2.9

 本试剂盒对人血白蛋白，小鼠血清，兔血清，鱼明胶没有交叉反应，而对山羊血清有 10%的交叉反应（以相同 OD 值时 BSA 和山羊血清的浓度的比值的百分数为准）。

和 BSA 没有交叉反应的物质
反应物质	反应浓度
人血白蛋白	10mg/ml
小鼠血清	10%
兔血清	10%
鱼明胶	1%

4、钩状效应
当样品浓度远高于标准曲线max浓度的时候，会产生 HOOK 效应，即反应 OD 值小于 32ng/mL 的 BSA 时候的浓度，本试剂盒为 500μg/mL 以上。

1、如样品中 BSA 含量高于 32ng/mL，可将样品做适当稀释。
2、样品如为冻干制剂，应用样品稀释液充分溶解混匀。
3、反应时应将整板放入洁净的密闭空间中，为防止反应孔中落入异物。
4、洗涤拍干后，应消除各孔内残余的气泡。
5、开封后，将未使用的板条放回加入干燥剂的密封塑料袋中，置 4℃密闭保存。