病理染色的成败关键！样本前处理核心技巧与避坑指南

病理染色是疾病诊断和科研的重要环节，样本前处理的规范性直接影响染色质量和结果准确性。本文针对三种常用切片技术（固定组织冰冻切片、新鲜组织冰冻切片、石蜡切片）的前处理步骤进行详细解析，为科研和临床提供参考。

一、固定组织冰冻切片

适用场景：需长期保存或特定抗原保存的样本。

步骤详解：

固定：
组织离体后立即浸入4%多聚甲醛或10%中性福尔马林，固定时间根据组织大小调整（通常10-20分钟至24小时）。短时间固定适用于小样本，而大块组织需延长至24小时以充分凝固蛋白结构。

梯度蔗糖脱水：
固定后依次浸入15%→30%蔗糖溶液（PBS配制），每浓度静置过夜至组织沉底。蔗糖渗透脱水可减少冰晶形成，维持细胞形态。

OCT包埋与切片：
脱水后组织置于冰冻切片机冷台，滴加OCT包埋剂完全覆盖，-20℃速冻10-20分钟。包埋后修块，调整切片厚度（通常8-10μm），贴片后室温晾干备用。

后固定与通透：
干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分钟，PBS冲洗后，以0.1% Triton X-100通透5分钟，增强抗体渗透。

二、新鲜组织冰冻切片

适用场景：术中快速病理诊断或保存脂类/酶活性。

步骤详解

速冻与包埋：
新鲜组织离体后直接置于冰冻切片机冷台，滴加OCT包埋剂速冻10分钟。若需暂存，可液氮速冻后-80℃保存。

切片与干燥：
调整切片厚度（8-10μm），贴片后室温干燥30分钟，使切片紧密附着载玻片。

后固定与通透：
干燥切片浸入4%多聚甲醛（4℃）固定10分钟，PBS冲洗后，以0.1% Triton X-100通透5分钟，增强抗体渗透。

三、石蜡切片

适用场景：高分辨率组织结构观察及长期存档。

步骤详解：

固定：
组织切为3-5mm薄块，4%多聚甲醛固定12-24小时。大标本（如肿瘤）需延长至24小时以充分渗透。

脱水与透明：
梯度乙醇（70%→100%）逐级脱水，每级1-2小时；二甲苯透明2次（各15-30分钟），置换乙醇便于石蜡浸润。

浸蜡与包埋：
熔融石蜡（60℃）浸渍组织2小时，包埋成块后4℃暂存。浸蜡需彻底以避免切片碎裂。

切片与烤片：
切片机切取4μm薄片，65℃烘烤1-2小时增强附着力。烤片后二甲苯脱蜡（15分钟×2次），乙醇梯度水化至PBS。

关键注意事项

1、固定时间：短于12小时可能导致固定不充分，超过24小时可能影响抗原表位。

2、脱水梯度：乙醇或蔗糖浓度需严格递增，避免组织收缩变形。

3、OCT包埋：
包埋剂需覆盖组织全周，避免气泡；切片方向应标记清晰。

4、切片厚度：
冰冻切片宜8-10μm，石蜡切片4μm，过厚易脱片或染色不均。

通过规范化的前处理流程，可最大程度保留组织形态与生物分子活性，为后续HE染色、IHC或mIHC奠定基础。实际操作中需根据实验目的灵活调整参数，并严格参照试剂说明书及行业标准。

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